基因工程重组蛋白的分离纯化 放映[精选].ppt

* 基因工程重组蛋白的分离纯化 生物工程下游技术 第七组 马夕尧 意义？？ 生物工程以基因工程为核心，主要产品为蛋白质或多肽。通过多年的努力，我国基因工程“上游”已与国外差距缩小，但“下游”技术，尤其是蛋白质纯化处理与先进国家相比， 仍有很大差距。 目录 一．获得基因工程产品的特点 二．建立蛋白质纯化工艺的依据 三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则 四．分离纯化的基本过程 五．几种主要蛋白质分离纯化的方法优缺点对比 一．获得基因工程产品的特点 ⑴ 目的产物在初始物料中含量低，而且往往在细胞内。含目的产物的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还含有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等，特别是产物降解酶、产物类似物等对目的产物的分离影响很大。 ⑵.目的产物一般是大分子物质，稳定性差，具有生物活性的物质对pH值、温度、金属离子、有机溶剂等十分敏感，容易失活、变性； ⑶.种类繁多，包括有大、中、小分子，结构简单或复杂的有机化合物以及结构复杂又性质各异的生物活性物质。对这些大分子基因工程产品的纯化缺乏必要的数据，似乎每种蛋白都有其独自的纯化方案，放大也往往凭经验，不像抗生素等小分子物质有很多数据可指导放大。⑷.应用面广，往往是注射用，对其质量、纯度要求高，无菌、无病毒、无热原。 ? 二．建立蛋白质纯化工艺的依据 2.1目标蛋白的各种性质 ①分子量大小，大的蛋白质先过凝胶柱； ②分子形状，球蛋白易扩散人凝胶过滤柱填料颗粒的小孔内，较迟洗脱出来； ③电荷与电荷分布，与离子交换紧密相关； ④疏水性，与疏水层析、反相高压色谱有关； ⑤.溶解度，影响因素有pH值、离子强度、离子的性质、湿度和溶剂极性等，可用于沉淀分离； ⑥密度，磷蛋白等密度大，可用密度梯度法分离； ⑦配体结合能力，用于亲和层析； ⑧金属结合能力，用于鳌合有金属离子的亲和柱； ⑨翻译后修饰，如连有糖基的蛋白可用于含有外源凝集的亲和柱，磷蛋白质在某些糖基下能与鳌合有FeZ的柱子结合。 2. 2物料中杂质的种类和性质 包括杂质的种类和含量、化学性质、分子结构、相对分子量、电荷性及数量、生物学特性、稳定性(对于热、pH值、盐、有机溶剂等)、溶解度、吸附性能等。 2. 3初始物料的特点 ①菌种类型及其代谢特性，包括菌种表达方式(是否以包含体形式)、副产物种类、产物类似毒素、蛋白酶种类、原材料和培养基的来源及其质量； ②生产工艺和条件，包括灭菌方法和条件、生产方式(连续、批式、半连续)、生产周期、生产能力、工艺控制条件、因素及方式等； ③初始物料的各种性质，包括产物浓度、杂质种类、浓度变化、盐的种类、浓度、溶解度、pH值、粘度等。 2.4产品质量的要求 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。 包括允许杂质种类和最大允许含量，特殊杂质种类和最大允许量。 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存稳定性等。 三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则 ①具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响，使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。 ②步骤之间尽量能衔接，减少工艺的步骤，同时工艺与设备也要相互适应，一般分离原理相同的技术在工艺中不要重复使用，既可减少周期，又能提高纯度和得率。 ③技术条件要温和，温度低，PH值适中，能保持目的产物的生物活性。 ④工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤或干扰产品质盆。 ⑤周期尽量短，因稳定性差的产物随工艺时间增加，收率、质量会下降。 ⑥目的蛋白质选择性好，能从复杂的混合物中将目的产物有效地分离出来，达到较高纯化倍数。 ⑦工艺和技术必须快速高效、收率高、易操作、对设备条件要求低、能耗低。 ⑧具有较高的安全性。在选择处理技术，工艺和操作条件时，要确保去除有危险的杂质，保证产品质量和作用安全以及生产过程的安全，药品生产必须保证安全、无菌、病毒、热原。 四．分离纯化的基本过程 样品的固液分离与预处理 基因工程药物多为胞内产物，分离提取这类物质时，需要经细胞收集细胞破碎细胞碎片分离等步骤 层析纯化 细胞破碎 针对这种结构，细胞破碎方法有机械破碎法和非机械破碎法，可以根据生产规模和活性蛋白在细胞中的位置，选择适当的方法。 机械破碎法是常用的方法，速度快，处理量较大，不会带人其他化学物质，但在处理过程中产生热量，必要时要采取冷却措施，以防止目的产物失活。现常用方法有高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法。 非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法。酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶