大肠杆菌感受态制备及转化[精选].ppt

实验一 大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化 实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 实验原理 转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化中的受体细胞 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用的变异株（受体细胞）有DH5α,top10,JM109等细胞 实验原理 转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法 感受态细胞：经处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。 实验原理 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pCT74质粒共保温，实现转化。 pCT74质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 影响转化率的因素 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。 实验仪器 实验试剂 ? 大肠杆菌DH5α ? LB培养基， ? 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） ? 氨苄青霉素 pCT74质粒 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化 实验步骤 菌株活化 1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养过夜 2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃振荡培养过夜 3．将培养液以1：50-1：100的比例转到100mlLB培养基中振荡培养1小时，到OD600＝0.3－0.4 实验步骤 感受态细胞制备 4．将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min 5．4000rpm离心5min,弃上清 6．加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,轻轻悬浮沉淀，（注意：此时细胞很脆，不能剧烈振荡，以免细胞破裂）冰上预冷10min 7．4000rpm离心5 min,弃上清 8．加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存 实验步骤 转化 9．??? 取目的DNA（稀释好的pCT74质粒50μl）加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 10．??于42℃水浴90S 11．??冰上放置2min 12．??加入800μlLB液体培养基于37培养1小时 13．??将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 14．?将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果 对照组 实验报告 写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂 详细列出实验步骤； 将转化的实验结果拍照打印并贴到实验报告上。 * * AmpR 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 超净工作台 离心设备 台式高速冷冻离心机 恒温空气摇床 恒温培养箱 培养皿 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。  对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 实验结果 *