ELISA檢测食品中黄曲霉毒素B1的方法学研究.doc

毕业论文（设计）开题报告 （理工类） 题 目： ELISA检测食品中黄曲霉毒素B1的方法学研究 系 （部）： 轻化工程学院 年级、 专业： 09级食品质量与安全 学 生 姓 名： 熊小云 学 号： 0904110021 指 导 教 师： 林巧 日 期： 2012-10-9 主要研究内容、研究意义及预期目标： 研究内容黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，具有很强毒性，能强烈破坏人和动物的肝脏组织，严重时会导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素主要有B1、B2、G1、G2以及另外两种代谢产物M1、M2。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。在中国，产生黄曲霉毒素的产毒菌种主要为黄曲霉。黄曲霉毒素B1是黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的二次代谢产物，毒性强，分布范围广，在很多食品中普遍存在，对人类健康的危害性极大。在所有的真菌毒素中，黄曲霉毒素B1的毒性、致癌性、污染率均居首位。经测定，敏感动物(雏鸭口服)的LD50=0.294mg/kg，比氰化钾的毒性高10倍。我国质监总局明确规定，针对大米、面粉、食用植物油、酱油、食醋五大类食品实行“市场准入”制度，其中黄曲霉毒素Bl是必检项目。目前黄曲霉毒素检测方法尚不能满足对样品批量测定和现场检测的要求。 酶联免疫法又称酶联免疫吸附法，酶联免疫吸附法(ELISA)方法是利用免疫、酶及生化技术来检测AFB1，开辟了AFB1分析的新领域。1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者Uan Weerman和 Schuurs分别报道了将免疫技术发展为检测体液中微童物质的固相免疫测定方法，最初主要用于病毒的检测，70年代中后期开始用于真菌毒素的检测。其原理是:先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分，然后加入酶的作用底物催化显色，，进行定性或定量测定，这种方法称为酶联免疫吸附试验，简称ELISA (enzyme linked immunosorbant assay)。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不会使酶本身的酶学活性受到太大的影响，在底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。根据反应产物的颜色可以进行定性或定量检测。 研究意义对酶联免疫吸附法(ELISA)方法来测定食品黄曲霉毒素B1的含量的可行性、可靠性，进而可以一定量的减少酶联免疫吸附法(ELISA)方法对检测过程中出现的系统误差，也可以减少由于环境的不同，以及检验仪器的不同而引起的随机误差；本实验通过对酶联免疫吸附法(ELISA)方法的线性范围、灵敏度、精确度、准确度研究是具有重要意义的，可以更加准确的测定食品中黄曲霉毒素B1的含量，进而可以更加确定该食品是否符合国家相应的规定。 预期目标本实验通过对ELISA试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1的可行性进行系统的研究和验证。建立了ELISA方法评价指标，确立了ELISA定量分析的质控参数，证实了ELISA方法用于农产品分析的可行性，为推进ELISA试剂盒的推广应用提供技术参数。以此方法来测定苦荞茶中黄曲霉毒素的含量，并判断该种苦荞茶是否符合黄曲霉毒素的含量标准。 拟采用的技术路线、研究方法及步骤： 1.技术路线 购买黄曲霉毒素B1标准液→配制不同浓度的黄曲霉毒素B1标准液→检测→分析 2.研究方法 2.1线性范围 ELISA检测过程中会受到试剂、温度、仪器灵敏度等因素的影响。为了考察检测方法的可靠性，确定定量范围，将ATB1标准溶液浓度按不同的浓度依次加到酶标板的孔中，测定吸光度值，以对数浓度为横坐标，Ai/Ao为纵坐标，绘制检测曲线。选定成线性关系的区间，就是其线性范围。 2.2 灵敏度 以测定浓度依次降低的黄曲霉毒素B1标准溶液在450nm时的吸光值来确定最低检测浓度，即检测的灵敏度，分别配制不同浓度的黄曲霉毒素Bi标准溶液，即0.05μg/kg, 0.1μg/kg, 1μg/kg, 2.5μg/kg, 5μg/kg, 10μg/kg。该方法的灵敏度是指检测样品测得最低浓度的A个浓度就是最低检测浓度。从表值与0.0μg/kg测得的A值的差0.1读数，这个浓度就是最低检测浓度。 2.4精密度 在ELISA检测范围在线性范围内，针对黄曲霉毒素B1标准曲线做在同一天内，在几个不同时间段配制的AFB1标准液进行平行5次检测和同一批配制的AFB1标准液进行平行5次检测，并计算5次平行测定的标准差，测定检测结果的变异系数。 2.4准