PCR技術的应用全攻略.doc

PCR技术的应用全攻略 主要内容： 一、引物设计 二、PCR 成分 三、PCR 反应参数 四、提高PCR 扩增特异性 五、PCR 产物测序 六、PCR 污染与对策 一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction)--聚合酶链式反应具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。 何谓PCR ??? 简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。 PCR的要素???? 基本的PCR须具备１.要被复制的DNA模板 (Template) ２.界定复制范围两端的引物(Primers). ３.DNA聚合酶 (Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。 所谓 Denaturing乃是将DNA加热变性， 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。 最后在DNA聚合酶 (e.g. Taq-polymerase) 的作用下进行引物的延长 (Extension of primers)及另一股的合成。 PCR 的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容整理出来，与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。?一、引物设计所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。设计软件有很多，既可以在线设计（如Primer3 /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用Primer5、Oligo6.65 等等。1. 引物设计的原则细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：1）典型的引物18 到24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。2）选择GC 含量为40％到60％或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。3）设计5端和中间区为G 或C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。4）避免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为0~-2时,PCR 产率可达100%, ? G=-6 时,为40%.5）避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5 个核苷中含有3 个A 或T。6）避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 结尾，防止AT 的松散结合引起错配。7）避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。8）引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。两引物的Tm 值相差不应大于5℃。计算Tm 有几种公式。第一个公式(Wallace 规则):Tm = 4℃（g + C） +2℃（a + T）,这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于15-20个碱基的引物,也适用于手工设计时的简单计算。第二个公式(Baldino 算法)适用于计算14-70个核苷酸在≤0.4mol\L 的阳离子溶液中的Tm, 也可用于扩增产物的Tm 计算.Tm=81.5+16.6*lg[K+]+0.41(%[G+C])-(675/n)。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排列而计算的，事实上相同碱基组成的引物Tm 可能差异不小：GGGAA 和GAGAG 的Tm 是不一样的，所以确定引物Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序如Primer5 等均使用近邻分析法。9）当在引物5’端添加酶切位点时要考虑：a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点