补充内容一抗生素__培训课件.ppt

三、PCR 聚合酶链式反应（polymerase chaireaction,PCR） 为一种在体外快速扩增特定基因或DNA的方法，又称为无细胞 克隆技术。 N次循环后，扩增DNA区段的理论拷贝数：2n 常规PCR主要步骤 PCR流程图 反向PCR：可以使靶序列两侧 的未确定区段得以扩增 * 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 * a-鹅膏蕈碱 抑制真核RNA聚合酶II和III * 寡霉素:为氧化磷酸化能量转移的抑制剂之一，与F0F1-ATP酶的F0部分结合，阻塞质子通道，从而抑制ATP的合成和分解 短杆菌肽S是迄今为止研究得最详细的一种与细胞膜发生相互作用的环状肽类抗生素.它的作用机理是破坏细胞膜结构,导致细胞内含物的释放,而最终引起细胞的死亡. 凝胶浓度： T（Acr和Bis总浓度）%= ×100% C（交联剂百分比）%= ×100% a=Acr克数 b=Bis克数 m=缓冲液体积（ml） a+b m b a+b 凝胶浓度T% (C=2.6%) 分子量kD范围 凝胶浓度T% (C=5%) 分子量kD范围 5 30-200 5 60-700 10 15-100 10 22-280 15 10-50 15 10-200 20 2-15 20 5-150 （2）据电泳形式分为 圆盘电泳、平板电泳等 圆盘电泳：在玻璃管中进行的凝胶电泳 平板电泳：在铺有凝胶的玻板上进行的电泳 （3）电泳系统 PAGE根据有无浓缩效应分为两大系统：连续系统和 不连续系统（具有分离胶和浓缩胶） 不连续系统的不连续性体现在： 凝胶孔径的不连续性（浓缩胶孔径大，分离胶孔径小） 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 电位梯度的不连续性 （4）SDS在PAGE电泳体系中加入十二烷基硫酸钠（SDS） SDS与蛋白质结合产生两个后果：SDS带有大量的负电荷，在其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可以分子量差异将各种蛋白分开；同时SDS与蛋白质结合引起蛋白质构象的改变，使蛋白质都成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。 由此，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数有关。 电泳体系中巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键断裂，使多肽组分分成单个亚单位。 （5）聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2-D） 利用蛋白质的等电点和相对分子质量的特异 性，将蛋白质混合物在电荷和相对分子质量两个水 平上进行分离。 等点聚焦（Isoelectric focusing,IEF） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）技术。 等点聚焦 SDS双向电泳 电泳结果 五、蛋白质免疫印迹实验(Western-blotting) Western-blotting：又称免疫印迹分析技术，是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支持物上，然后以特异的亲和反应、免疫反应或结合反应以及显色系统分析此印迹。 免疫印迹电转移方法 六、蛋白质定量测定 （一）微量凯氏定氮法 消化：蛋白质（或其它含氮有机化合物）与浓H2SO4共热时，其中碳、氢两种元素被氧化成CO2和H2O，而氮元素转变成NH3，并进一步与H2SO4反应生成(NH4)2SO4，残留于消化液中，该过程通常称为“消化”。 消化完毕后，加入过量浓碱（如NaOH）使消化液中的(NH4)2SO4分解放出NH3，以蒸馏法借水蒸汽蒸出的NH3，用一定量、一定浓度的H3BO3溶液吸收。NH3与酸溶液中H+结合成NH4+，使溶液中的H+浓度降低，然后用标准强酸（如盐酸）滴定，直至恢复溶液中原来的H+浓度为止。 (NH4)2SO4 + NaOH → Na2SO4 + 2NH4OH NH4OH → NH3 + H2O 3NH3 + H3BO3 → 3NH4+ + BO33－ BO33－ + 3