Tmmu實验操作手册.doc

Chip 操作手册 需要但试剂盒不提供的材料 抗体（做chIP或者EMSA的专用抗体，浓度比通常wb抗体高10倍） 37％甲醛; Taq 酶; dNTPs; Dnase 和RNAse; 斡旋混合器; 摇床; 细胞刮刀;超声破碎仪 ChIP 步骤： 准备工作：细胞培养 碎冰块若干 冰冷PBS 将SDS lysis buffer 放于室温（确保SDS在裂解缓冲液中） 蛋白酶抑制剂融化备用 一、交联和裂解 1、 10cm的细胞培养平皿中，细胞生长融合80％左右，分组：正常对照组， 实验处理组，培养体系为10ml。每个平皿加入270ul 37％的甲醛（终浓度为1％），轻轻水平摇荡平皿――室温10min； 2、 准备EP管，每个管中加入1ml冰冷的PBS和5ul Protease inhibitor cocktail，置于冰上孵育; 3、 细胞培养平皿中加入1ml 10×Glycine 终止未反应的甲醛，室温摇荡5min； 4、 平皿置于冰上； 5、 尽量吸弃培养液； 6、 平皿中加10ml冰冷的PBS，洗涤细胞，重复洗涤一次； 7、 将步骤3中准备的加好抑制剂的1ml PBS加入平皿； 8、 细胞刮刀刮下，收集于EP管； 9、 700g，4℃离心2－5分钟收集细胞； 10、 离心过程中，准备1ml SDS裂解缓冲液，加入5ul 蛋白酶抑制剂。（1ml是针对2×107hela细胞，推荐的裂解体系，可以针对实验进行调整） 11、 离心的细胞去上清。（该步骤可以冻存于－80℃） 12、 细胞沉淀中加入上步骤准备的1ml SDS裂解液 13、 吸取300－400ul 裂解产物，分装并冻存于－80℃ 14、 如果已经优化了超声条件，进入下步骤，否则，进行优化。 二、超声剪切DNA 1、 取上面的裂解产物5ul作为未剪切的对照（agarose 电泳） 2、 细胞裂解液的超声处理：EP管置于湿冰中，使用有探头的超声仪，50瓦，10sec 超声4－5次。 3、 12000g－15000g离心4℃ 10min，去除不溶物质； 4、 取5ul以备agarose电泳 5、 上清吸入新的EP管，并100ul分装，－80℃可以保存数月 三、免疫沉淀交联的蛋白/DNA 1、 每个IP反应，需要900ul 稀释缓冲液（加4.5ul 蛋白酶抑制剂），样本包含阳性对照，抗RNA聚合酶II，阴性对照，正常小鼠IgG，兴趣抗体。推荐应用与兴趣抗体同种属的阴性对照抗体作为对照。 2、 取100ul经过剪切的交联染色质，置于冰上。（每个反应体系应该有相当于2×106数目细胞的染色质） 3、 加入步骤1中的900ul稀释液； 4、 每个反应加入60ul 蛋白G agarose（用前将蛋白G混合均匀；该步骤是预清除，目的是去除与蛋白Gagarose非特异性结合的蛋白或者DNA； 5、 4℃ 摇荡1h； 6、 3000－5000g离心1min（不要高速离心，过速可能导致粒子变形等）； 7、 吸取上清10ul（1％），作为input（第四步应用）； 8、 将上清吸到新EP管； 9、 加入免疫沉淀抗体: a 阳性对照，加入1ug抗体（抗RNA聚合酶），； b 阴性对照，加入1ug抗体（正常小鼠IgG）； Note：抗体加入量1－10ug，根据经验调整 4℃摇荡过夜 10、 加入60ul蛋白G agarose ，4℃摇荡1h，目的是沉淀抗体－抗原－DNA复合体。 11、 3000－5000g离心1min，弃上清 12、 洗涤蛋白G agarose－抗体－染色质DNA复合体，应用1ml冰冷的buffer，共4种，按顺序洗涤：a. 低盐buffer ――b 高盐buffer――c. Licl buffer――d TE buffer (两次)每次洗涤，在平板摇床上摇荡3-5min，3000-5000g离心1min。 四、溶解蛋白DNA复合物 准备1M的NaHCO3，准备65℃水浴 1、 准备Elution buffer：每个IP反应 10ul 20％SDS，20ul 1M NaHCO3，170ul H2O。（共200ul体系） 2、 或者准备大容积的Elution buffer比如按照10个IP反应准备 3、 对于Input ，加入200ul Elution buffer ，放于4℃。 4、 加入100ul Elution buffer，轻轻混合, 室温孵育15min; 5、 3000－5000g离心1min，收集上清于新的EP管 6、 重复4－5步，并合并洗脱液，共200ul 五 蛋白/DNA解交联 1、 所有反应管（IP和input）加入8ul 5M