Western_blot的原理操作及注意事項.doc

Western blot的原理、操作及注意事项 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞： 细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。 B.蛋白的定量方法 电泳估算法（我们选择此法）： 样品倍比稀释，SDS电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。 以提取癌组织总蛋白为例： ① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。 ② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。 ③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成； ④ SDS电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。 二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE） A：实际操作 做胶前的准备 1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。 2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。 3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。 制胶，电泳 凝胶的浓度取决于目的蛋白的分子量大小，目的蛋白分子量越大，则凝胶浓度越低。 1）装好架子。 2)按照下面配方配制分离胶。(单位：ml，Total： 8ml) 7.5％ 10％ 15% 2×Sep. buffer 4 4 4 30％ Gel.sol 2.0 2.7 4 ddH2O 1.9 1.2 0 TEMED 8ul 8ul 8ul 10%APS 80ul 80ul 80ul 在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。 3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。(单位：ml，Total： 3.5ml) 3％ 2×Stacking. buffer 1.7 30％ Gel.sol 0.35 ddH2O 1.4 TEMED 5ul 10%APS 50ul 倒好后插入预先准备好的梳子。 4)待胶凝集好后，上样，电泳。 上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在1.5小时左右。上样量：一般为20-40ug，根据样本中待测蛋白的表达水平，做出合适的优化。上样量过多会出现非特异性染色；过少则会导致检测不到出现假阴性的结果。 蛋白质分子量 Marker 蛋白质分子量 Marker 的使用，是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证！预染 Marker 更方便直接观察电泳和转膜效果。 B ：注意事项及常遇到的问题 1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。 2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) 。 3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。 4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。 5）电泳中常出现的一些现象： ︶ 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 ︵ 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部