紫外法测核酸解析.ppt

* * * * * * * * * * * * * * 紫外法测量核酸浓度 Contents 目录 实验原理 实验方法 注意事项 分析与拓展 实验原理 01 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。 。 结构基础 1-1 计算方法 1-2 试液中DNA / RNA总含量按最下所示计算： 式中 甲A 260 ——被测稀释液在260nm处的总光密度值； 乙A 260 ——加沉淀剂除去大分子核酸后被测稀释液在260nm处的光密度值； 两者之差（甲A 260 －乙A 260 ）为被测稀释液的光密度值； V B ——被测试液总体积（mL） D——样液的稀释倍数。 0.020——脱氧核糖核酸的比消光系数，即每毫升含1mu;gDNA钠盐的水溶液（pH为中性）在260nm波长处，通过光径为1cm时的光密度值。 0.022——核糖核酸的比消光系数，是浓度为1mg/L的核糖核酸水溶液（pH为中性）在260nm波长处，通过光径为1cm时的光密度值。 由于大分子核酸易发生变性，此值也随变性程度不同而异，因此一般采用比消光系数计算得到DNA或RNA量是一个近似值。 实验方法 02 实验材料 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。 . 样品RNA或DNA干粉 5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。 . 2-1 1.准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/L NaOH调成糊状,再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。 2.取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样 品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min。 3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5 mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。 4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。 RNA=A260/A280=2.0（注释） 实验步骤 2-2 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。 注释说明 2-3 注意事项 03 1. 紫外分光光度计使用前要预热。 2. 比色皿应成套使用，注意保护,不能拿在光面上。 3. 离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须 从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然 后将转速打到最低。 3注意事项 分析与拓展 04 如果待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则可将样品配制成一定浓度的溶液（20~50μg/mL）在紫外分光光度计上直接测定。? 而上述实验步骤中采用比消光法，针对当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时加入了钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm 处光密度作为对照。? 方法讨论 4-1 由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约40％，这就是众所周知的增色效应。在大分子的核酸中，氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为。因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度，该现象称为减色效应。 误差分析 4-2 4-3 方法拓展 核酸分子中的共轭π键具有紫外吸收性质，核酸溶液的吸收度与核酸的浓度呈正比，可用作定量测定。 DNA、RNA分子在强酸作用下降解的糖，再与浓酸、酚或胺生成的有色化合物，其颜色深浅与核酸含量呈正比，因此通过比色法可测得核酸的含量。 元素分析表明，RNA含磷量平均为9.4%，DNA含磷量平均为9.9％，由此可以推导出核酸质量约为其含磷量的11倍，因此可从测得的核酸样品的含磷量计算核酸的含量。 测定核酸浓度的方法 01定磷法 02间接比色法 03紫外吸收法 UV法COD测定技术即紫外吸收法是基于测定试样对紫外光的吸收来测定物质成分和含量的方法。紫外吸收法是选定一定波长的光照射被测物质溶液，测量其吸光度再依据吸光度计算被测组分的含量计算的，理论根据是吸收定律它是朗伯定