细胞实验技术-课堂PPT-实验七解析.ppt

细胞生物学 李石营 神经再生重点实验室 lisy0379@ 不要死记！ 主动的理解和推理！而不是被动的接受！ Why？Question yourself！ 第一节 流式细胞术（FCM）测定细胞周期 和 真核细胞转染 第二节 总结 流式细胞术（FCM）测定细胞周期 细胞周期测定 原则: 最显著的变化特征。 染色质： 流式细胞仪 流程 分析？ 細胞周期位相的決定 流式细胞术（FCM）测定细胞周期 定义： 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 特点： 1.细胞及细胞器不被破坏。 2.测量速度快，约每秒5000—10000个细胞 3.可进行多参数测量 4. 综合性的高科技方法（ 综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术） 5.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术 小结 1、细胞周期 推理 、定义、特征。 2、测定的推理 3、流式细胞仪 4、结果分析 真核细胞转染 转染：外源基因 导入 细胞。 意义：研究外源基因对细胞的作用。 方法： 1.脂质体载体法 2.电转法 3. 病毒 4.磷酸钙-DNA共沉淀法 脂质体转染法 原理：脂质体为人工膜泡（脂质双层），将DNA或RNA包裹于内，由于脂质体具有磷脂双层与胞膜相似，因此，可与细胞膜融合，将DNA转入宿主细胞。 脂质体转染法 流程 1、以合适的细胞密度接种培养板上。转染时，细胞要达到80%左右。 2、管1：OPTI-MEM + lipo 2000 按比例混合（温育5min） 管2：OPTI-MEM + 质粒按比例混合。 3、将管1与管2 溶液混合，室温下置20min。 4、将反应液逐滴加入加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。 5、6小时后更换完培，在37℃，5％CO2培养箱中48-72h检测转染水平。 电转法:高脉冲电压瞬间破坏膜电位，DNA通过膜小孔进去。 病毒：病毒侵染细胞。 磷酸钙-DNA共沉淀法：磷酸钙-DNA共沉淀物，可使DNA附在细胞表面，被细胞内吞。 影响因素： 1.细胞的状态与密度 2.转染的质粒 3.血清等其它影响因素 4.操作影响 4. 48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。 * 不要好不容易记住了，但不知道它的意思。 不要看着流程能做实验。 要理解实验，能自己把握和分析实验！ 细胞生长和增殖 DNA Synthesis Gap phase： preparation for DNA synthesis Gap phase： preparation for mitotic Mitotic M G2 G1 S 分裂间期（interphase） 4N 2N 2N→4N 2N 24 H 12 h 6-8 h 3-4 h 0.5-1 h 细胞内容物合成（rRNA、 蛋白质、脂类、糖类等） 后期，DNA合成酶活性 大大增加 DNA合成 大量合成ATP、 RNA、蛋白质 及一些分裂因子 定义？ 细胞周期 细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞所经历的过程。 G1期(gap1)，分裂完成到DNA复制之前。 S期(synthesis phase)，DNA复制阶段。 G2期(gap2)，DNA复制完成到分裂之前。 M期，又称D期，分裂开始到结束。 G0期，休眠或称静止细胞。 根据细胞周期可将高等动物细胞分为3类： ①连续分裂细胞。 ②休眠细胞，暂不分裂，适当刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞。 ③不分裂细胞，又称终端细胞，不再分裂。 4N 2N 2N→4N 2N 4N 基本工作原理 荧光标记的细胞 分析 分选 标记：PI 嵌入DNA 染色 PI不能穿透细胞膜 打孔，triton-X-100 RAN干扰结果 RANase消化RNA 细胞周期在一直进行 乙醇固定终止 单个细胞 和 洗涤 1. 制备单细胞悬液 ？ 2. PBS洗两遍 ？ 3. 预冷的70%乙醇于4℃固定过夜，或-20℃长期固定 5. 用triton x-100的100ul PBS重悬， 加入100ug/mL RNase A，37 ℃ 30min 4. 离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞1-2次 加入 溴化乙锭（PI），4度孵育30min 8. 标准程序用流式细胞仪检测。 流式细胞术测定细胞周期 7. 过300或400目筛网 结果？ 2N 4N DNA content Cell count 4N 2N 2N→4N 2N 4N G0/G1 S G2/M 大 G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0 G1