04定量3讲解.ppt

第二节 分光光度法 紫外-可见分光光度法 原子吸收分光光度法 荧光分光光度法 红外分光光度法 1、称取维生素C 0.0500g溶于100 mL的5 mol/L硫酸溶液中，准确量取此溶液2.00 mL稀释至100 mL，取此溶液于1cm吸收池中，在λmax＝245nm处测得A值为0.498。求样品中维生素C 的百分质量分数。 2）标准加入法 高效液相色谱法 气相色谱法 薄层色谱法 1.固定相 常用化学键合相，分极性和非 极性键合相，如十八烷基硅烷键合硅胶 （C18或ODS）和辛基硅烷键合硅胶（C8） 为最常用的非极性键合相，用于反相色 谱法；氨基和氰基硅烷键合相为常用的 极性键合相，用于正相色谱法。 3.检测器 常用紫外检测器;电化学检测器;二极管阵 列检测器(DAD);荧光检测器（选择性） 示差折光及蒸发光散射检侧器（通用型） 质谱检测器（专属、灵敏） 定义：指用规定的对照品对色谱系统进行 试验，应符合要求。 1.分离原理 注入进样口的样品经加热气化后，被载气带入色谱柱，由于其分配系数的不同进行分离，各组分先后进入检测器，信号记录仪、积分仪和数据处理系统记录色谱信号。分配系数小的组分先流出，分配系数大的组分后流出。 毛细管柱和填充柱 为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子(T)是否符合各品种项下的规定, T应在0.95～1.05间。 4）拖尾因子 T = W0.05h/2d1 按各品种项下要求对色谱系统进行系统适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整。 三、测定方法 HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰面积，定量依据是样品中组分的量(或浓度)与峰高或峰面积成正比。常用的定量方法有外标法、内标法和内加法。 1．峰高和峰面积 各种色谱峰峰高示意图 正常峰面积 ： A=1.065Wh/2×h 不对称峰的面积可用平均峰宽来计算： A＝1/2·(W0.15h + W0.85h) ×h 一般说来，当分离度小或流量波动时，常用峰高定量。当峰形不正或色谱柱超负荷时，用峰面积定量。 2．外标法 用与待测组分同质的标准品作对照品，以对照品的量对比求算试样含量的方法称为外标法。外标法是HPLC常用定量分析方法之一。 含量(C样品）＝ C对照×A样品／A对照 峰形为正常峰时，式中的峰面积A可用峰高h代替。 (3)内标加校正因子法：被测组分单位峰面积所相当物质的量与 内标物单位峰面积所相当物质的量的比值。这是相对重量校正因子，简称校正因子。常自行测定，其测定方法是配制含有内标物的对照品溶液，在完全相同的实验条件下，进样5～10次，分别测定峰面积，代入下式求各组分的相对重量校正因子。 fi = （mi/Ai）/（ms/As） 式中mi与ms分别为待测组分与内标物的量；Ai与As分别为它们的峰面积。 用内标校正因子法进行定量分析时，准确称取ms克的内标物，加入样品内混匀，进样，则i组分与内标物重量间有下述关系： mi/ms = （Ai fi ）/（As fS ） 如果样品量为m克，则i组分在样品中的百分含量为： Ci％＝（Ai fi ）/（As fS ）×（ms /m）×100％ 二、气相色谱法 2.对仪器的一般要求 除另有规定外， 载气：惰性气体（氮气、氦气） 色谱柱：毛细管柱或填充柱 检测器：氢火焰离子化检测器 进样口温度：高于柱温30~50℃ 检测器温度：高于柱温，不低于150 ℃ 进样量：数微升 * * 灵敏度高，可达10-4g/ml ～ 10-7g/ml 准确度高，RSD（%）为2% ～ 5% 仪器价格低廉，操作简单，易普及， 应用广泛 许多药物都可以采用此法测定，还可 以应用计算分光光度法不经分离直接 测定混合物中各组分 一、紫外-可见分光光度法 1.特点 2. 朗伯-比耳定律 单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的波长范围内被该物质吸收光的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度）成正比。 A = ECL 吸收系数：摩尔吸收系数ε 百分吸收系数 当物质的浓度为1%（g/ml),溶液厚度1cm时的吸光度