酵母各种杂交分解.ppt

设计含目的基因（诱饵）和下游报告基因的质粒，将其转入酵母细胞中。 将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母细胞中。 若文库蛋白与目的基因相互作用，可通过报告基因的表达将其筛选。 实验过程简单，耗时短：能直接识别并找出与特异顺式作用元件相结合的蛋白质及其编码序列，而不需通过制备纯化蛋白或抗体等繁琐的生化手段来建立这种相互作用关系； 酵母属于真核生物，且蛋白质处于自然构象，避免了体外研究的不足。 与内源性的表达激活因子发生相互作用； 假阳性：插入的靶元件有可能不需要转录激活因子就可以直接激活报道基因的表达； 假阴性：融合蛋白有毒性、不能稳定地表达，错误折叠不能准确定位于酵母细胞核内、DNA 结合位点被封闭； 酵母细胞内蛋白修饰缺乏； TF: 介导蛋白质相互作用的第三种因子， 可以是蛋白质,DNA,RNA或小分子配体。 两个蛋白之间通过第三者发生相互作用，用来检测蛋白质与RNA、蛋白、小分子配体间相互作用 酵母三杂交技术 1、研究RNA-蛋白质间相互作用 2、研究小分子受体与蛋白质受体间相互作用 在该系统中, 第三个杂交小分子为Dex(地塞米松)-FK506 偶联体, 利用已知的地赛米松受体和FK506 受体FKBP12 分别构建AD 和BD 融合蛋白, 三种分子相互作用后, 成功的激活了报道基因的表达;而当单体FK506 分子引入时, 由于竞争性结合FKBP12 , 导致三元复合物无法形成, 几乎完全抑制了报道基因的表达。 3、研究复杂的蛋白-蛋白间相互作用 不能用来研究位于细胞核外的RNA分子； 许多蛋白质需要辅因子作用使其结合到它们的对应的RNA上，然而这些辅因子可能定位于细胞的其他区域不能在核中发挥作用（假阴性）; 不适用经过转录后修饰才能与蛋白质结合的 RNA分子 细胞内进行 核酸水平 操作简单 假阳性 假阴性 对核外分子无用 对需要进行复杂转录后修饰的分子无用 谢谢！ 请多多指教O(∩_∩)O 2016-7 相关知识： 1、顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，作用是参与基因表达的调控。 2、反式作用因子（转录因子）：能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。 3、报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。 4、cDNA文库：以mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。 基本原理 真核生长转录因子含有两个结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成的结构域： 转录激活结构域(AD) (activation domain) DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain) 转录激活因子 BD：识别DNA上特定序列，转录激活域定位调控 基因的上游。 AD：与转录复合体其他成分作用，从而启动所调节基因的转录。 两个结构域分开时仍具有功能，但不能激活转录，只有他们以适当 途径在空间上相互靠近时，才能具有转录因子活性，激活报告基因的表达。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达，探测蛋白-蛋白的相互作用。 酵母双杂交原理示意图 X DBD Reporter gene Prey Bait AD Y Expression UAS DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147氨基酸,可识别并结合酵母半乳糖苷酶的上游激活序列(UAS) 。 转录激活域（AD）：C端786-881氨基酸,通过同转录机制的其它成分之间的结合以启动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。 1、构建质粒（诱饵蛋白不发生自激活） 2、转化酵母细胞（本身不表达GAL4） 3、阳性筛选 1.（1）BD-plasmid 靶基因(蛋白A基因)按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。 筛选标志：TRP （2）AD-plasmid 蛋白B基因按正确阅读框 克隆到GAL4的AD片断 之后。 筛选标志：LEU2 （1）双载体转化能合成亮氨酸和色氨酸。 Trp- Leu- 2. 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c） 3.筛选观察 （2）筛选蛋白A和蛋白B能相互作用的双载体转化子。 Trp- Leu- His- 酵母细胞 cDNA文库 诱铒蛋白基因 多克隆位点 DNA-BD 载体 AD 载体 转化 转化 酵母细胞 筛选平板生