药品检验用菌种的传代和保藏2剖析.ppt

药品微生物检验用菌种的传代和保藏 浙江省药品检验所 叶铭龙 菌种的定义及其与各应用领域的关系 菌种泛指从自然界获取的各种微生物的不同的种。 医学领域研究菌种主要考虑其致病机理 工业生产研究菌种主要考虑其发酵机理 药品微生物检验主要考虑其标准性 标准菌种的概念及其管理 标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。 我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供 标准菌种的保藏形式 我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。 纯培养 所谓微生物的纯培养是指在一个微生物的菌落形成单位中，所有的微生物细胞或孢子都属于生物学的同一个种。严格地说，纯培养是在培养基上由一个细胞或孢子分裂、繁殖而产生的后代。在该细胞或孢子的生长过程种，不受其他微生物的侵犯，不会在培养物中产生另外微生物种的后代，在整个生长过程中不发生变异或死亡。 获取纯培养的工作环境 1、洁净工作室：环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区域内，全过程必须无菌操作，防止微生物污染。 2、无菌隔离舱 获取纯培养的接种工具 1、接种环 2、接种针 3、接种铲 4、接种钩 5、其他玻璃器械 获取纯培养的其他器具 1、玻璃器皿：如各种规格培养皿。 2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌锅、恒温培养箱等 获取纯培养的主要技术－移植（又称接种） 微生物的移植（或称接种）是指将微生物接种在培养基上的操作。 移植（又称接种）的两种方式－划线 和穿刺 1、划线法是指用接种工具将微生物细胞移植在固体培养基斜面或平板上的一种方法 。 2、穿刺法是指用接种工具将微生物细胞移植到固体或半固体培养基内的一种方法。 影响集菌培养效果的若干因素 温度 渗透压 氧气 光 pH值和氧化还原电位 培养基 抗生素 验证纯培养的主要依据 1、用显微镜观察时，全部的生物个体是相似的，如果是细菌，对革兰氏染色反应应当是一致的。 2、将培养物制成悬液，重新倾注平板，或平板划线培养后，所形成的全部菌落的形态应该是相似的。如果是细菌，将重新形成的菌落各作穿刺培养，其培养特征应当是一致的。 3、从重新分离的各菌落作生理特征观测时，如对氮源的利用，对糖类的发酵或同化以及其他生理生化的测定，应呈现出一致性。 定期移植保藏法 一般步骤为：将菌种接种在所要求的培养基上，置最适温度下集菌培养。得到健壮的菌体（如有性孢子、无性孢子或细胞等）后，放于温度较低、干燥处保藏，并且每隔一定时间重新移植培养一次。 定期移植保藏法 1、细菌置4～6℃保藏，芽孢杆菌每3～6个月移植一次，其他细菌每月移植一次。 2、放线菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。 3、酵母菌于4～6℃保藏，每4～6个月移植一次。 4、丝状真菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。 5、担子菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。 6、保藏的湿度通常在50％～70％为宜。 定期移植保藏法 1、需定期检查 2、移植进行时，应仔细核对 3、集菌培养完成后，应比较培养特征 4、应注意观察各代之间的变化 琼脂斜面低温保藏法 1、菌种的典型菌落接种至斜面，规定的温度和时间培养，充分生长，硅胶塞换成无菌橡胶塞。 4～6 ℃冰箱保藏 a:1～3个月移植一次，继续保藏。 b:用半固体高层培养基穿刺培养，可保藏半年至一年。 琼脂斜面低温保藏法 适用细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏 优点：简便、大多数微生物适用 缺点：保藏期短；传代次数多；容易发生变异及污染。 生孢梭菌用硫乙醇酸盐培养基、乙型溶血性链球菌及肺炎球菌用血肉汤（琼脂）培养基 液体石蜡保藏法 一般步骤为：准备液体石蜡并灭菌去水备用。获得需要保藏菌种的纯培养，将液体石蜡注入培养容器中，并完全覆盖培养基。 液体石蜡液面以高出培养基上端0.5～1cm为宜 4～6 ℃冰箱保藏 液体石蜡保藏法 确保保藏环境的干燥，避免长霉。 使用此法保藏的菌种时应特别注意防止微生物外溅污染。 该法对酵母菌的保藏最为有效，对大多数细菌保藏效果一般。 甘油冷冻保藏法 将保藏菌种接种琼脂斜面上，适宜温度下培养适宜时间，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使菌种充分扩散到无菌水中，调证菌液浓度，向已制备好的菌悬液加入等体积的20％无菌甘油，轻轻振试管管，使内容物充分混合，分装于无菌小管。甘油冷冻管最好在-30 ℃贮存。 沙管保藏法 制备沙管 培养接种 制备菌悬液 混菌 干燥 保藏 适合保藏芽孢杆菌、梭菌、放线