蛋白质的分离纯化与定性定量分析剖析.ppt

Ion-Exchange chromatography Ion-Exchange chromatography Size-exclusion chromatography Size-exclusion chromatography Affinity chromatography Affinity chromatography Commonly used affinity columns: Ni2+ ? binds to poly Histines (example 6xHis) Specific antibodies (anti-Flag tag) glutathione ? binds to GST Protein A or G ? binds antibodies Affinity chromatography Possible elution strategies: pH Ion strengh Denature Competitor ligand or analog Ni-NTA columns The high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged proteins or peptides is due to: 1- the strength with which these ions are held to the NTA resin 例如： 凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：180kD SDS（不加还原剂）结果：45kD SDS（加还原剂）结果：两条蛋白带（15kD和30kD） 则结论是： 该蛋白质由4个相同的亚基组成，每个亚基由两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链的分子量分别为15kD和30kD。 质谱法是最精确的分子量测定方法 质谱（ Mass Spectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。 由于ESI和MALDI两大电离技术的出现，质谱技术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分子量测定。精确度0.01～0.1％。 其他常用的蛋白质相关技术 蛋白质纯度的判定：HPLC、SDS、质谱 蛋白质序列测定技术：Edman测序法、质谱 蛋白质的空间结构测定：X射线晶体衍射分析、核磁共振 目前常用的印迹法有四种： Southern blot 检测DNA Northern blot 检测RNA Western blot 检测蛋白质 印迹法最常用的固体材料有硝酸纤维素（NC）膜和PVDF膜。 为减少非特异性干扰，需对固相载体进行处理，即用一种与待测物不反应的物质如蛋白质、核酸、吐温20等封闭载体上印迹以外的剩余吸附点（该过程称为封闭），使探针仅与印迹物起反应，且不吸附到载体上。 探针是用化学方法将能与待研究蛋白质结合的物质如抗体，与某些标示物如酶、同位素或荧光物质、半抗原等结合形成的复合物。 蛋白质印迹最常用的探针是酶联抗体（HRP酶或AP酶）。 Western blotting原理图示 蛋白质印迹的用途 用于检测样品中是否有特定蛋白的存在，并进行半定量分析。 基本操作步骤 样品的制备 细胞裂解物的蛋白定量 细胞裂解物的SDS蛋白质的转移 目的蛋白的检测 免疫印迹技术的注意事项 不能绝对定量，只能相对定量 各样品的上样量必须相同 选择合适的胶浓度 正负电极要确认 充分封闭 驱除气泡 注意保护膜，不能干燥 优点 样品加样位置和体积不受限制； 分辨率高于其它类型电泳； 可测定pI值； 缺点 样品在pI区域易沉淀，为增加样品溶解度，可以在胶中加入尿素，但导致蛋白质失活； 样品前处理麻烦。 等电聚焦的优缺点 3. 双向电泳 将等电聚焦技术与SDS技术组合起来的新技术，是目前分离蛋白质混合物最强大的技术，也是蛋白质组学研究的重要技术。 基本步骤：第一相等电聚焦后，在等电聚焦的垂直的方向进行第二相SDS。 pH 3 - - - - - - 10 （1） IEF 等电聚焦电泳 （2） SDS（3） 染色脱色 考马斯亮蓝 银 染 可综合利用层析和电泳分离纯化蛋白质 蛋白质的浓缩 超滤法 使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤的技术。 常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在膜内。 冷冻干燥法 在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的技术，保持蛋白质构象的最好方法。 注意：必须保证蛋白质始终处于冷冻状态（在－70℃冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂（右旋糖酐、甘露醇等）。 吸收法 采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。 PEG、蔗糖、凝胶干粉等。 沉淀法 硫酸铵、PEG、有机溶剂沉淀； 免疫沉淀。 3.