血红蛋白的提取与分离剖析.ppt

①调整缓冲液面：与凝胶面平齐。 ②滴加透析样品：用吸管将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端。 ③样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层。 ④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一试管，连续收集。 3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做） 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考： 与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？ 3.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 ——鉴定血红蛋白纯度 （1）试剂的配制 ①丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺? 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液 ②十二烷基硫酸钠（SDS）? 用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。 ③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液 ④ TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 ⑤用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。 ⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液? 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。 ⑦样品处理液? 50 mmol/L Tris—HCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。 ⑧染色液? 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸 ⑨脱色液? 10%的甲醇和10%的冰醋酸。 由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及其原理示意图 * 一、课题目标 本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。 二、课题重点与难点 课题重点： 凝胶色谱法的原理和方法。 课题难点： 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 思考3 人们用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。 一、基础知识： ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法） 1、凝胶 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类化合物构成,如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）。 2、凝胶色谱法的概念 根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行蛋白质分离。 3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ）；而( ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 4、具体过程 分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 ㈡ 缓冲溶液： 2、作用： 能够抵制（