质粒DNA的提取和PCR技术剖析.ppt

质粒DNA的提取和PCR技术 质粒提取 基本原理 操作步骤 注意事项 实验室安全 基本原理 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份.质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，碱裂解法是最常用的方法。 基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。当加入中和液后，因为闭环的质粒DNA分子虽然氢键破坏但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖，当加入溶液三后形成PDS被离心时可沉淀下来。 试剂准备 ： 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性 高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS作用沉淀 4.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）苯酚变性抽提蛋白，为tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚与水互溶。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少泡沫 5.异丙醇，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）沉淀质粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 RNase A：10mg/ml 操作步骤及注意事项 1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，于37℃振荡培养14～18 h。-培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。 2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解,DNA变性。-放置时间不能太长。因为在碱性条件下基因组DNA会慢慢断裂 。混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA 。 5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3-5min。-中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。6.12000g离心10min取上清，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。-抽提掉剩余蛋白。7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入0.5~0.7倍体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。-可以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min 离心。不要沉淀太久8.1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清，将沉淀在室温下晾干。-不要太干，否则不易溶解。9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。 10.琼脂糖电泳检测。检测，定量。 其它注意事项： 1。质粒质量： 首先实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。其次操作过程注意：避免基因组断裂，除净蛋白，盐离子清洗干净。 质粒数量：同量摇菌量中质粒量取决于质粒拷贝数。低拷贝数质粒可以通过添加氯霉素来增大拷贝数。 2。阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。 溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2 与NaOH作用,减弱了其碱性。 3。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时 如果能看到三条带，这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。 实验室安全： 1。培养细菌的容器用过后都要及时进行灭菌，细菌培养基上清不要随便丢弃，应存放在一起进行灭菌处理，以免污染环境。 2。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿 异戊醇时要在通风橱中进行，氯仿 可引起神经系统功能紊乱要引起肝脏损害 。异戊醇其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用 3。电泳时注意避免EB污染。 PCR技术 基本原理 反应动力学 使用步骤及注意事项 反应参数要素 PCR优化 PCR技术 聚合酶链反应