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第三章 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography，HPLC 第一节 高效液相色谱法概述 一、理论基础：速率理论 二、HPLC技术 采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器。 三、HPLC特点 高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便。 ㈠经典LC与HPLC比较 ㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点 分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。 ⒉流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；HPLC的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。 ⒊经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行 缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。 第二节 HPLC的主要类型 一、液一液分配色谱法（LLPC） 在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。 1．分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。 2.固定相 液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类： （1）全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等材料制成，直径约100 ?m的全多孔型颗粒。 这类固定相由于颗粒很细，孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 （2）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）：由直径为30 ~ 40?m的实心玻璃球和厚度约为1 ~ 2 ?m的多孔性外层所组成。目前，这种载体粒度为5 ~ 10 ?m。 ⑶化学键合固定相：它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。 它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。 据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。 3．流动相 根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。 二、液一固吸附色谱法(LSAC) 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。 1．分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附: X + nSad = Xad + nS 达平衡时,有 2．固定相 液－固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。 目前最广泛使用的还是5～10 ?m的全多孔型微粒填料。 3.流动相 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。 三、离子交换色谱法（IEC） 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。 1．离子交换原理 离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下： 阳离子交换： 达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）： 2.固定相 （l