第四章核酸杂交技术molecularhybridizationofnucleicacid.ppt

六、杂交的严谨性 严谨性（stringency)是指杂交体系避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严谨性，一般认为在低于杂交体Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式计算杂交体Tm 值。通过调节 盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。 七、杂交反应时间 C0t1/2是杂交反应进行一半时杂化分子的浓度，C0t1/2越大反应越快，具有5kb复杂性的1μg变性双链DNA在10ml的杂交溶液中反应2小时达到C0t1/2。复杂性( complexity)或者说序列的复杂性是指在DNA或RNA样品中不同序列的总长度，如果有机体中不存在重复序列，DNA的复杂性与其基因组长度相当。重复序列的复杂性与其单一拷贝的复杂性相当，和其重复次数无关。 八、杂交促进剂 惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。 本章小结 根据杂交核酸分子的种类，核酸分子杂交可以分为DNA与DNA杂交，DNA与RNA杂交，RNA与RNA杂交；根据杂交探针标记的不同，可以分为同位素杂交和非同位素杂交；根据杂交介质的不同，可以分为液相杂交、固相杂交和原位杂交；固相杂交又可以分为菌落杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交和狭缝杂交。 DNA芯片技术作为一种高通量、大规模、平行性的检测技术，在医学领域中具有独到的优势，为疾病诊断、治疗、预防和机制研究等提供了有力工具。 Thank you ! （二）Southern印迹杂交 Southern印迹杂交（Southern blot hybridization）技术包括两个主要过程： 一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）。 二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。 Northern印迹杂交 Northern 印迹（Northern blot）杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术。是由Alwin于1977年建立的，后经Thomas等人改进，主要用于分析mRNA分子大小迹mRNA转录情况。此项技术的原理与Southern印迹杂交相对应，故被称为Northern印迹杂交。 二、液相杂交 液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针于待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。液相杂交是研究最早的杂交类型，但应用的普遍程度较固相杂交为低。 第三节 DNA芯片技术 作为新一代基因诊断技术，DNA芯片具有快速、高效、敏感、经济及自动化等特点，与传统基因诊断技术相比，DNA芯片技术具有明显的优势： ①基因诊断的速度显著加快，一般可于30 min内完成； ②检测效率高，每次可同时检测成百上千个基因序列，使检测过程平行化； ③芯片的自动化程度显著提高，通过显微加工技术，将核酸样品的分离、扩增、标记及杂交检测等过程显微安排在同一块芯片内部，构建成缩微芯片实验室。 作为新一代基因诊断技术，DNA芯片具有快速、高效、敏感、经济及自动化等特点，与传统基因诊断技术相比，DNA芯片技术具有明显的优势： ④基因诊断的成本降低； ⑤实验全封闭，避免了交叉感染；且通过控制分子杂交的严谨度，使基因诊断的假阳性率、假阴性率显著降低。 重点提示 DNA芯片(DNA Chip)：是通过微阵列技术将大量已知序列的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有序地、高密度地排列固定于支持物上，然后与荧光标记的待测生物样品中的靶核酸分子根据碱基配对的原则进行杂交，通过检测分析杂交信号的强度及分布，对基因序列及功能进行大规模、高通量的研究。 原位合成（in situ synthesis）：是指直接在芯片上用四种核苷酸合成所需探针的DNA芯片制备技术。适用于制备寡核苷酸芯片和制作大规模DNA探针芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。 一、DNA芯片的概念与类型 DNA芯片(DNA Chip)是通过微阵列技术将大量已知序列的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有序地、高密度地排列固定于支持物上，然后与荧光标记的待测生物样品中的靶核酸分子根据碱基配对的原则进行杂交，通过检测分析杂交信号的强度及分布，对基因序列及功能进行大规模、高通量的研究。 二、DNA芯片原理 DNA芯片的的技术基础是根据Waston和Crick提出的DNA碱基互补配对原则而发展出来