动物细胞基因组DNA中小卫星多态性的Southernblot检测..docx

动物细胞基因组DNA中小卫星多态性的Southern blot检测实验目的：掌握核酸杂交检测技术（Southern blotting技术）、核酸探针的标记技术、小卫星DNA多态性检测分析技术（DNA 指纹图谱技术）和化学发光检测技术。实验原理：Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待检测的核酸分子通过一定的方法转移（电转印、虹吸转印、真空转印）并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素、尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与特定标记[放射性同位素、地高辛（DIG）、生物素（biotin）等]的核酸探针在一定温度和离子强度下复性（退火），即分子杂交。该技术是1975年英国爱丁堡大学Southern发明的，固命名Southern印迹杂交技术。利用Southern印迹杂交技术可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组中某一基因的定性和定量分析、基因突变分析及限制性长度片段多态性分析（RFLP）。固相膜核酸分子杂交的主要步骤及原理如下：1、DNA的变性： DNA变性解链是杂交成功的关键。Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性，变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5M NaCl和0.5M NaOH中1h然后用数倍体积的1M Tris-HCl (pH8.0)和1.5M NaCl溶液中和1h。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好，可避免DNA降解。热变性在要低DNA浓度（100μg/ml）和低盐浓度（0.1M SSC 含15mM NaCl - 1.5mM柠檬酸三钠，pH7.0）下进行。用SSC稀释DNA溶液为50μg/ml，加10M NaOH使最终浓度为0.1M（pH约12.8），室温变性10min，很快置冰盐水中，用10M HCl或5M NaH2PO4调pH到7~8（亦可用碱变性后，调至中性，再加热100℃10min），DNA变怀可用OD260增加（约30~40%）来检测，变性DNA沉淀呈雪样，完全失去纤维状沉淀。变性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。2、变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定： 硝酸纤维素滤膜（孔径0.45μm）先在蒸馏水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min~2h，凉干。DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，先室温干燥4h，然后在80℃真空干燥2h。DNA样品也可以转移或加至尼龙膜（nylon membrane）上，再用高温烘烤或紫外交联的处理固定在尼龙膜上。3、预杂交： 湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋或杂交管中，按每平方厘米滤膜加0.2ml预热至60℃的预杂交液（6×SSC，0.5% SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理，然后酒精沉淀纯化，调浓度至10mg/ml，用前放100℃水浴中煮沸变性10min，冰水骤冷。若在塑料袋中杂交，尽可能将袋中气泡赶尽，可封口器将袋口封住。将杂交袋浸入68℃水浴保温3~12h。当预杂交液温度升至68℃时，在滤膜表面常会形成小气泡。轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡，这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。若在杂交管中杂交，只需将杂交管置入核酸杂交炉（箱）内的旋转支架，调解到到一定转速和杂交温度，完成杂交。4、杂交： 从水浴中取出塑料袋，用剪刀剪开一角，尽可能挤净预杂交液。用吸管或大枪头将杂交液加入袋中，用恰好是足量的液体保持滤膜湿润（50μl/cm2）。溶液的组成是6×SSC，0.01M EDTA, 变性的标记核酸探针，5×Denhardt液，0.5%SDS, 100μg/ml变性的鲑鱼精DNA。尽可能赶尽气泡后，将塑料袋严密封口，杂交反应在68℃水浴中进行，所需时间视探针和检测靶DNA的性质及探针的比活性等情况而定，一般4~20h。若在杂交管中杂交，只需倾去预杂交液，杂交管内加入含杂交探针的杂交液，继续在核酸杂交炉完成杂交。5、洗膜： 取出塑料袋，用剪刀剪开，小心取出滤膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盘中，室温下漂洗5min。再将滤膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室温下洗涤15min（轻轻摇动）。然后将滤膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃轻轻摇动保温2h，更换缓冲液后继续保温30min。洗膜的温度一般应控制在低于Tm值12℃以上。若在杂交管中洗膜，只需倾去杂交液，杂交管内加入相同洗膜液，继续在核酸杂交炉旋转洗膜。6、结果显示：固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式，一是放射性自显影法，另一种是液闪计数法。前一种方法比较简单，只需将杂交膜与X光片在暗盒中曝光数小时至数天，再显影、定影即可。对于杂交信号较弱的固相膜，用一块增感屏可显著增强曝光强度。固相膜的非放射性杂交检测一般采用化学发光技术。常用的化学发光