实时定量PCR实验故障排除..doc

实时定量PCR实验故障排除 扩增曲线 原始数据 Spectra：各波长的原始信号 没有标准曲线 没有标准曲线 没有扩增曲线 原始数据只有1个循环Spectra ?只有1个循环的数据原因：1.收集数据的步骤只有一个循环，只收集了一个数据点2.电脑为了节省电源而休眠，通讯中断，1个循环后的数据丢失 原因1：PCR参数设置错误原因2：硬盘休眠 从原始数据找原因 从第1-第9个循环，ROX的信号升高并逐渐下降。 在所设定的4-13基线范围内，ROX信号值是变化的，而FAM的信号值基本上是固定的，经过FAM/ROX的校正后，比值自然不相等，所以基线不是水平的直线，而有下滑部分。ROX的信号变化与所用试剂的质量有关。 应该取10-20为合理的基线范围。   解决方法修改基线范围为10-20，重新分析。重新分析的结果基线范围取10-20，重新分析后的图谱。第1-9循环的信号为负数，由于试剂质量引起。 增曲线分成两段扩增曲线断裂 ?原因：基线的终点大于CT值， 通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值 15，而基线仍然取3-15， 其中包含部分扩增信号，导致标准偏差偏大，阈值过高 解决方法：减小基线终点，至CT值前4个循环，重新分析数据 样品浓度跨度太大直线扩增曲线原因：探针部分降解 V形扩增曲线 V形扩增曲线 V形扩增曲线 扩增微弱或者信号很弱 ROX信号不稳定  扩增曲线不光滑原因：信号太弱解决方法?使用高质量的探针?补救方法：1.7000的SDS软件升级到v1.1 2.关闭ROX校正，重新分析数据关闭ROX校正的效果ROX帮助故障诊断(1)现象：重复性很差 正常的原始数据原因：盖子未盖紧，溶液蒸发排除蒸发的数据后 ROX帮助故障诊断(2)现象：山坡形扩增曲线原始数据显示有蒸发引物二聚体SYBR Green I?化学，Dissociation curve试验?推荐措施：提高引物设计质量，避免形成引物二聚体?补救措施：优化引物浓度和退火温度?也许：专设80度步骤收集信号？