实验一基因组DNA的提取..doc

实验十 菌落PCR筛选阳性重组子 【实验目的】 学习利用菌落PCR技术筛选阳性重组子的方法 【实验原理】 细菌细胞内的重组DNA以裸露状态存在。在高温条件下，细菌细胞破裂，细胞内DNA暴露并因高温的作用而变性成为单链状态的DNA，此时该DNA可作为模板用于PCR，进而检测该DNA中是否含有重组的外源DNA序列。 【仪器、材料与试剂】 1 仪器 生化培养箱，超净工作台，离心机，PCR仪，电泳仪，电泳槽，连续可调移液器，凝胶成像系统 2 材料 含待检测菌的阳性筛选平板，PCR试剂盒，引物1（primer 1）和引物2（primer 2），PCR管，移液器枪头，ddH2O，电泳级琼脂糖，Tris碱，硼酸。 3 试剂 PCR试剂盒：10X PCR buffer，MgCL2或MgSO4，dNTPs，DNA聚合酶； primer 1和primer 2：均配成10μmol的使用液； DNA Marker：根据PCR产物大小确定。 【实验步骤】 1 配制25μL的PCR反应体系 10× buffer 2.5 μL MgCL2或MgSO4 1.5～2.5μL（若buffer里有，则可不加或少加） dNTPs（2μmol） 2.5μL primer 1 (10μmol ) 1μL primer 2 (10μmol ) 1μL Taq 酶（或其他用于PCR扩增的DNA聚合酶）1U ddH2O 补至25μL 最后用移液器挑取筛选平板中的待检测菌落，放入上述反应体系中。 2 PCR程序 配制好反应体系后，将其放入PCR仪中。然后根据最初设计引物时的相关数据，设定PCR程序中的每一步的反应条件。通常设计的反应条件如下： 94℃ 预变性 3～5min； 94℃ 变性 30sec～1min 50～60℃ 退火 1min 30～35个循环 72℃ 延伸 2min 72℃ 最终延伸 8～10min 设定好程序后，即可开始运行程序，进行PCR。 3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测见实验六 PCR完成后，取5～8μL PCR产物与适宜的上样缓冲液（loading buffer ）混匀后，加样电泳。待电泳完成后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。 【注意事项】 1配制PCR反应所用PCR管及移液器枪头要洁净、无菌，反应体系配制时要仔细，防止液体飞溅。 2要选取清晰、散落的菌落进行挑菌，防止沾染其他菌落或杂菌。 【思考题】 1 菌落PCR扩增时应注意哪些问题？ 2 菌落PCR扩增鉴定阳性重组子的依据是什么？  实验十一 重组质粒的酶切鉴定 【实验目的】 学习并掌握重组质粒酶切鉴定的原理和方法 【实验原理】 重组质粒除了具有原有质粒多克隆位点（MCS）以外的酶切位点外，由于引进了外源DNA序列，因此还具有外源DNA所携带的相应酶切位点。通过分析重组质粒与原有空质粒中的酶切位点的差异，选择合适的限制性内切酶进行酶切，再通过分析重组质粒与空质粒酶切序列长短的变化情况，可以确定是否获得了重组质粒。 【仪器、材料与试剂】 1 仪器 恒温水浴（或恒温金属浴），电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像系统。 2 材料 待酶切鉴定的重组质粒；与重组质粒相对应的空质粒。 3 试剂 酶切所需要的限制性内切核酸酶及其反应缓冲液； DNA Marker：根据酶切片段的大小选用适宜的DNA Marker； loading buffer： 6×或10×含溴酚蓝的上样缓冲液。 【实验步骤】 1选择适宜的限制性内切核酸酶。 根据载体的序列，利用软件（如 Clone Manager）分析，选择适宜的限制性内切核酸酶。 2 根据所选择的限制性内切核酸酶的相关信息（最适反应温度、离子条件等）选择相应的酶切体系。 不同的限制性内切酶具有各自最佳的反应缓冲体系和反应温度，因此要结合所购买酶的具体情况，选择合适的一种或两种酶进行酶切。 3 配制酶切体系，进行酶切。 根据所购买酶的说明书，配制酶切所需要的反应体系。通常酶切体积需要在20μL以上；如果进行多酶联合酶解，则应注意：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意避免酶切序列重叠现象；对盐浓度要求不同的酶，可采取使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；或者先用低盐酶酶切，然后补加盐，再用高盐酶酶切