实验五鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定..doc

实验五 鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定 一、实验目的和要求 1） 设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验方案。 2） 设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验操作条件。 3） 了解离子交换层析系统中四大组成部分和实验主要影响因素。 4） 掌握熟离子交换层析层析仪的使用方法和注意事项。 5） 学会凝胶预处理和装柱、平衡、洗脱的方法。 二、器材和试剂 1．实验器材： 层析系统LH-2，（包括自动部分收集器，紫外检测仪，记录仪，蠕动泵，梯度混合器）6套；高速离心机；布氏漏斗；烧杯500ml,100ml，各16个；移液管1、2、5ml, 各16个；量筒50ml,100ml，各16个；真空干燥器 4个；滴管， 16个；滤纸φ120， 1盒； 2．实验试剂： (1)丙酮；(2)1％，pHl.15的三氯乙酸：将称取的三氯乙酸置烧杯内，加入2／3总体积的蒸馏水溶解，用6mol／L氯氧化钠调至约pHl.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积；(3)0.02 mol／L,pH6.5，磷酸盐缓冲液；(4)0.5mol／L氯化钠—0.5mol／L氢氧化钠溶液；(5)0．5mol／L盐酸溶液；(6)0.3mol/L氯化钠—0.02mol／L磷酸盐缓冲液，pH6.5；(7)底物缓冲液：0.05mol／L，Tris-HCl缓冲液，pH8.0，内含2.22mol／L的氯化钙；(8)2mmol／1,BAEE底物：用底物缓冲液配制；(9)lmg／mL胰蛋白酶溶液：用0.001 mol／L盐酸配制；(10)DEAE-纤维素粉(DE-32)；(11)SphadexG-25；（12）鸡蛋 30个；（13）1％硝酸银 三、实验原理 1．蛋清中蛋白质结构组成为：卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G2、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制剂、抗生物素蛋白。 2．鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid，CHOM)的性质: 鸡卵类黏蛋白(chickenovomucoid，CHOM)是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，对枯草芽孢杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化胰蛋白酶。 鸡卵类黏蛋白至今还未能获得单一组分的制品，目前至少已获得4种不同组分，它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上差别不大，但是在糖基部分(主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸)的含量有差别。由于Ovomucoid所带的糖基不同，电泳行为呈现出不均一性，其pI大致在3.9-4.5，相对分子质量28 000，卵类黏蛋白抑制胰蛋白酶的摩尔比为1：1。 卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都相当稳定，而在碱性溶液中不稳定，尤其是当温度较高时会迅速失活。Ovomucoid带有四种糖基，因此有较强的吸水性。在50%丙酮或5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。所以，选择合适的pH，丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。Ovomucoid 在280nm处的百分消光系数A1%1cm.280 = 4.13，即蛋白酶浓度为1mg/ml时,溶液的吸光度A280 = 0.413 ，据此可以测定其溶液中蛋白质的含量。 本实验主要参照Kassell的方法，鸡蛋清经三氯乙酸(TCA)—丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗晶，再用DEAE-纤维素柱层析纯化而得合格产品。 四、实验步骤 1．鸡卵类黏蛋的提取 取50mL鸡卵清，加入等体积的10％，pH1.15三氯乙酸溶液(缓缓加入以防局部过酸出现块状物)，形成类似于酸奶状的白色沉淀，轻轻地搅拌均匀。在酸度计上检查最终pH值应为大约3.5，若pH值偏离3.5±0．2则要用5mol／L氢氢化钠或5mol/L盐酸调节pH值，由于提取液非常稠，在调节pH值时防止局部过酸或过碱。pH值调好稳定后，在室温下静置4h以上。待卵清清蛋白完全沉淀后，以3000r／min离心10min。弃去沉淀物，上清液用滤纸过滤，以除去上清液中脂类物质及其他不溶物。收集滤液转入500mL的烧杯内。检查滤液的pH值是否为3.5，否则要调回到pH3.5。置冰浴或冰箱内冷却片刻，缓慢加入3倍体积预冷的丙酮，用玻璃棒轻轻搅匀，用塑料薄膜盖好封严，在冰浴里放置2～4h，待鸡卵类黏蛋白完全沉淀后，小心虹吸出一部分上清液，剩余的部分全部转移到50mL带盖的离心杯里，加盖经平衡后以3000r／min离心15min，除去上清，沉淀物放在真空干燥器内，抽气除去残留丙酮。使沉淀物由白转变为透明黏稠物后停止抽气。加入20mL蒸