实验八酵母菌的发酵培养..doc

实验八 酵母菌的发酵培养 一、实验目的 1、熟练掌握5L发酵罐的结构和使用方法。 学习掌握。 4、掌握。 在需氧代谢中，菌体生长是以基质代谢和氧的消耗为基础的，因为他们提供了生长所需要的前体物质和能量，而且从基质和氧的消耗速率也可以反映菌生长的状况和阶段。 本实验在50 L发酵罐中进行酵母培养，可保证发酵全过程生长条件的一致性（较之摇瓶），对菌的生长代谢分析有参数的稳定性和可靠性。酵母的生长以葡萄糖为碳源，随着葡萄糖的利用，酵母生长同时也会产生代谢副产物-小分子酸，因此要用氨水调节pH。氨水消耗的多少与糖代谢相关。 分批发酵中，酵母生长会出现延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期等阶段，通过测定菌量就可以了解生长情况与阶段。 三、实验材料与试剂 1、菌种 酵母菌由西南科技大学生命科学与工程学院生物工程教研室提供。 2、器材 电子天平高速离心机蒸汽灭菌锅超净工作台生化培养箱 3、试剂 酵母提取物，蛋白胨，葡萄糖，氨水 4、培养基 种子培养基配方（1 L）：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、pH 5.5。 发酵培养基配方（1 L）：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、灭菌前pH 5.5，泡敌0.1 %。 补糖配方（1 L）：葡萄糖200 g、K2HPO4 10 g、MgSO4·H2O 1.6 g、NH4Cl 1.4 g 四、实验步骤 1、种子培养基的配制及种子培养 种子培养基的配制：按照种子培养基配方，配制1500mL培养基，并用盐酸调好pH，分装到5个500 mL的摇瓶中，每瓶300mL，用松棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸包扎好瓶口。放入高压灭菌锅121℃，灭菌20min。 接种：在超净工作台上用无菌接种针挑取一针斜面菌种，接入已灭菌的种子培养积极，包扎好瓶口，没接种一瓶种子需换一根接种针，以免染菌。 种子培养：放入30℃摇床培养，转速120～150r/min，培养16 h。 2、发酵罐的空消 对发酵罐空气管路、发酵罐和取样口等进行灭菌。空消时间一般为30-50min，在灭菌过程中，罐压控制在0.11-0.12MPa之内，严禁超压。 3、发酵培养基配制 按照发酵培养基配方，计算出30L培养液所需各成分的含量并称取。用自来水溶解后装入发酵罐，定容至30L。 4、实消 将培养基置于发酵罐中，用蒸汽加热灭菌，这种灭菌叫实罐灭菌。为了减少冷凝水的产生，实消开始时，先打开进夹套的蒸汽阀和夹套下排水，并开启搅拌。当温度到90℃时，关闭夹套进气阀，开启进发酵罐内的蒸汽阀，并继续升温到工艺要求。灭菌过程中应时刻注意罐压，并控制在0.08MPa之内，严禁超压，罐压的控制通过调节排气阀来实现。 注意在升温过程中不要开温控开关，否则当上、下设定值定在培养温度时，冷却水管中的水会自动通冷却水，不仅会影响升温速度，浪费蒸汽，更重要的是会引起冷凝水过多，引起培养液浓度变化。实消温度为121℃，灭菌时间为15min。灭菌结束后，关闭进气阀，用冷却水进行冷却。 当蒸汽阀门关闭以及通冷却水后，发酵罐的罐压将迅速下降，当罐压降至0.03MPa时，必须开启进气阀，使无菌空气进入发酵罐内，使罐压保持在0.03-0.05MPa。 当罐内温度降至70℃以下时，调节搅拌电机的调速器，慢慢搅动培养基，加快冷却速度，同时可稍开进气阀，调节排气阀，使罐压保持在0.03-0.05MPa。 5、 将培养好的种子5瓶，在超净工作台上合并成2瓶，并用无菌棉塞塞好，待接种。火焰接种法从发酵罐的接种口倒入种子，盖上接种口盖子，撤去火圈，调节溶氧浓度到80%。余下的一瓶种子用于菌体干重测定。 6、 培养温度：30℃；搅拌转速：200r/min；溶氧浓度20%以上，当溶氧低于20% 时增加转速，提高供氧；残糖浓度控制在0.5% 左右，低于0.5%时流加20%葡萄糖，流速根据糖耗速率调整。 7、实验数据记录 发酵情况记录表： 序号 取样时刻 发酵时间 葡萄糖浓度 OD600 pH 溶氧（DO） 学生签名 OD1 OD2 平均OD 8、计算 1）糖消耗曲线的绘制 每隔4h从发酵罐取出30 mL发酵液，取其中10 mL，3000 r/min离心。取0.5 mL上清液残糖。测定残糖用苯酚硫酸法。绘制糖消耗曲线，即糖浓度对时间的变化曲线。 2）生长曲线的绘制 发酵6 h开始取样每隔2 h取样一次，至12 h以后每隔4 h从发酵罐取出30 mL发酵液，取其中1 mL适当稀释后用分光光度计在600 nm波长下测定吸光度（OD600），要求OD600值在0.2～0.6之间