实验四细胞色素C的制备及含量测定..doc

课程名称： 生物制药技术实验 第 4单元（节）， 4 学时，授课时间2010 年11月24日，地点 202 项目/主题： 实验四 细胞色素C的制备及含量测定： 能力目标 掌握细胞色素C的制备及含量测定的基本知识 知识目标： 掌握细胞色素C的制备及含量测定原理和操作。 重点难点与解决方案： 细胞色素C的制备，演示解决 教材、参考资料与媒体： 自编教材，参考网络上的一些相关知识 教学条件（环境）：100分钟讲授，30分钟演示、110分钟巡回指导和学生操作 实验目的 掌握细胞色素C的制备方法和它的基本原理。 二、实验原理 细胞色素是一类含有铁卟啉基团的电子传递蛋白，它是细胞体内膜上呼吸链中重要的电子传递体，只存在于需氧细胞中。需氧多的如心肌及酵母等细胞中含量丰富。细胞色素C是细胞色素的一种。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许多来源获得细胞色素C结晶，并已对40多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。结果表明，细胞色素C的氨基酸残基的数目为103～111，不同来源的细胞色素C的氨基酸残基的顺序及含量都有一定差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高，等电点为10.7，含铁量为0.38～0.43%，分子量为12，000～13，000。 细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，帮常用酸性水提取。细胞色素C分为氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热较稳定，不易变性。在PH7.2～10.2，100℃加热3分钟，细胞色素C氧化型和还原型变性程度也较稳定，可抵抗0.3mol/L盐酸和平共处0.1mol/L氢氧化钾溶液和长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的，因此较稳定并易于保存。 细胞色素C的吸收光谱，氧化型细胞色素C最大吸收峰为408 nm,530nm；还原型的最大吸收峰为415nm,520nm和550nm。 常以含量较高的心肌和酵母等为材料进行分离制备。本实验以新鲜猪心为原料经过酸溶液抽提。制品用分光光度法测定细胞色素C溶液的含量。 三、实验试剂 （1）2mol/L硫酸 （2）1mol/L氢氧化铵 （3）人造沸石：为白色颗粒，不溶于水，溶于酸。选用60～80目。 再行方法：使用过的沸石，先用自来水洗去硫酸铵，再用0.2～0.3mol/L氢氧化钠和1mol/L氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，最后用水反复洗至PH7.0－8.0,即可重新使用。 （4）0.2%氯化钠溶液 （5）25%硫酸铵溶液 （6）20%三氯乙酸 （10）10%乙酸钡溶液 （11）0.06mol/L磷酸氢二钠－0.4mol/L氯化钠溶液：称取21.5g磷酸氢二钠，23.4g氯化钠，加水溶解，定容至100ml （12）标准细胞色素C溶液（80mg/ml） (13)连二亚硫酸钠 （14）1mol/L乙酸 （15）0.02mol/L磷酸二氢钾溶液 四、实验器材 部分收集器 离心机 色谱柱 透析袋 尼龙纱布 可见分光光度计 五、操作 1、提取： 称取100g猪心肌肉糜，加水200ml，用2mol/LH2SO4调PH至4.0，在室温下搅拌提取1小时，用1mol/L氢氧化铵调PH至6.0,离心3000r/min，10min，收集上清液。 2、吸咐及洗脱： 用1mol/L氢氧化铵将上述提取液调PH至7.2，静置20～30min，收集上层澄清液，将下层悬浮液，离心3000r/min,10min,取下清液与前面的液体混合，待上柱。 把人造沸石装入层析柱，约12～15cm。 将提取液上柱，通过人造沸石进行吸附，流速约为8～10 ml/min，随着细胞色素C被吸附，柱内的人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液为淡黄色或微红色。 先用H2O洗脱，再用0.2%NaCl洗涤，再用H2O洗涤至清，用2.5%硫酸铵洗脱，流速为2ml/min，收集含细胞色素C的红色洗脱液。直至红色消失才停止收集。 3、盐析： （1）除杂：按每100ml洗脱液加入20g固体硫酸铵，边加边搅拌，静置半小时以上，离心除去杂蛋白（3000r/min，10min），可得到红色清亮的细胞色素C溶液。 (2) 沉淀细胞色素C：在搅拌下100ml溶液加入2.5 ml 20%三氯乙酸，离心（3000r/min，15min）,收集沉淀。 4、透析： 用少许H2O将沉淀溶解，装入透析袋，除盐，用BaCl2溶液检测透析外液，无SO42-为止，得到细胞色素C溶液。 5、含量测定： （1）标准曲线的制定：浓度为横坐标，A为纵坐标。 （2）样品测定：取0.4ml待测样品，用水稀释至10ml，取1ml稀释液加3ml水，加少许连二亚硫酸钠，摇匀，测A520nm.根据标准曲线计算其浓