鸡胚接种技术[精选].ppt

第二章 鸡胚接种技术 一、概况 1911年Rous和Murphy首先应用鸡胚培养研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。 1938年Goodpasture和Burnet等应用鸡胚繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克次体。 第一节 鸡胚的结构与生理 鸡胚是由三个胚层发育起来的，即外胚层、中胚层和内胚层，它们构成胚胎的组织与器官。 （约10日龄鸡胚的结构见图） 卵壳与壳膜 卵壳位于最外层的坚硬壳层； 壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子 交换，因此培养鸡胚需一定的湿度和气体。 气室 功能主要是呼吸和调节压力。 绒毛尿囊膜 壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官。 羊膜 胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。 尿囊腔 位于绒毛尿囊腔和羊膜之间 ，胚胎排泄器 官含5－20ml尿囊液，含大量的尿酸盐， 为减少沉淀，盐水稀释再4℃保存。 卵黄囊 主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养。 卵白 外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养。 第二节 鸡胚的孵育和检查 受精鸡卵的供给 — 没有受到病毒和细菌的污染如新城鸡瘟病 毒、布氏杆菌等； — 培养立克次体和衣原体，不能来自食用抗 生素的鸡群。 鸡胚的孵育 — 温度为38～39℃； — 湿度为40％-70％； — 翻蛋：防止蛋白粘连，促进羊膜运动和空 气流通； — 通风：排出CO2和吸入O2。 检卵 — 血管：活胚可见清晰的血管，有时可见血 管搏动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。 — 胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在 转动胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎 发红像出血样，有的呈现黑块。 — 绒毛尿囊膜发育界限：发育好的鸡胚可见 密布丰满的血管网，也就是绒毛尿囊膜， 死胚则见不到这一现象。 第三节 鸡胚接种途径及方法 （一）羊膜腔接种 应用于从临床材料中分离流感病毒等，病毒感染后可收集羊水和尿囊液。 接种步骤与方法 将10~12日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。 消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约10mm×6mm的长方形裂痕，注意勿钻破壳膜。 再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察胚胎的位置。 将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入O.1～0.2ml病毒液。 拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳的窗口封住，于33～35℃孵育48～72h，要保持鸡胚钝端朝上。 羊膜腔接种法 解剖与收获 收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，但不能放置时间过长(过长会引起散黄)。如急于收获亦可置-20℃冰箱lh左右。 预冷的目的是，将鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。 病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。 （二）绒毛尿囊膜接种 常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，因为这些病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶。 另外，病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定，因为感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑和痘的数目来计算。该方法还可用于抗病毒血清的滴定试验，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成受到抑制。 将孵育l0~13日龄的鸡胚标记气室、胎位，于与胚胎略近气室端卵壳上划一等边三角形。 消毒气室顶端及记号处，用开孔器在记号处的卵壳上开一三角形裂痕，不可弄破下面的壳膜，同时在气室顶端钻一小孔。 轻轻揭去卵壳，露出壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖循卵壳膜纤维方向划破一隙，勿伤及紧贴的绒毛尿囊膜。 用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头紧按气室小孔向外吸气，此时盐水小滴即可自裂隙流至绒毛尿囊膜上，从而使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室。 在卵壳的窗口滴0.05~0.1ml病毒液于绒毛尿囊膜上，然后将旋转鸡胚使接种物扩散到整个绒毛膜尿囊膜上。 在卵壳的窗口周围涂石蜡，用消毒胶布封口。将鸡胚保持人工气室在上的位置，33~35℃继续培养48～72h。 绒毛尿囊膜接种法 解剖与收获 用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状或用于传代，或用50％甘油保存。同时作无菌培养。 （三）尿囊腔接种 广泛应用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养，这些病毒被接种到尿囊腔后，可在内皮细胞中复制，复制的病毒被释放到尿囊液中，因此，在尿囊液中含有大量的病毒。 取9~11日龄的鸡胚，标记气室与胚胎位置，并在胚胎面与气室交界之边缘上约1mm处避开血管作一标