总RNA的提取与RTRealtimePCR..docx

总RNA的提取与RT、Realtime-PCR一、实验原理RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。1．RNA提取的最大影响因素-RNA酶但是由于RNA酶（RNase）广泛存在且稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压等。RNase催化的反应一般不需要辅助因子，因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，所以RNA的制备过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。外源性的RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。2．常用的RNA酶抑制剂*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNase抑制剂。它通过和RNase的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。*异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNase抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNase失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNase有强烈的变性作用。*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNase结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNase的活性。*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNase的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNase结合，使其失活。*其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNase也有一定抑制作用。3．防止RNase污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作*尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。*操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入各种容器内或污染用具。尽量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free处，扩大污染。*尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如滤纸、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H、T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。*关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNase污染，买来后可直接用于RNA操作。用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNase，从而导致实验失败。*所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。*无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNase的活性。*配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。*有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。（Northern Blot）*配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。二、仪器和试剂1．仪器与器皿超净工作台、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、移液器、电泳仪、凝胶成像系统、振荡器、各种吸头、EP管、研钵（或玻璃匀浆器）、镊子、剪刀、金属小勺、保温罐、液氮、乳胶手套。研钵（或玻璃匀浆器）、剪刀、镊子、小勺等洗净后，锡箔纸包好200℃干烤6h；不耐高温的器皿（如各种吸头、EP管等）用0.1%DEPC水浸泡过夜（至少10hr以上），120℃高压20min灭菌和除去残留的DEPC，再烘干使用。2．试剂（1）无RNase纯水：0.1% DEPC处理过夜，高压灭菌。（2）TRIzol RNA抽提试剂（3）氯仿、异丙醇、70%酒精（RNase Free用无RNase水配制）（4）10X凝胶缓冲液吗啉代丙磺酸（MOPS）（pH7.0）2