感受态细胞的制备和重组质粒的转化..doc

1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 【实验原理】 质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。 微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。 【试剂与器材】 〈一〉试剂1．LB液体培养基: 参见附录??? ?每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）: 配1L LB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal和100μL 0.1mol/L IPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。? 每组制备LB平板2个，LB/Amp 平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。3．IPTG储存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。5．1 mol/L CaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。6．甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。 〈二〉器材1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等2. 高速冷冻离心机3. 微量移液器等 〈三〉菌株? 大肠杆菌DH5α，基因型为 【操作方法】 1、感受态细胞的制备（无菌操作）:1）从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5α大菌落接种到3 mL LB培养液中（2），37℃剧烈振荡（210-240r/min）培养过夜（3）。2）取1mL过夜培养物, 接种到含100mL LB培养液的500 mL锥瓶中，37℃剧烈振荡，直至培养液中细菌浓度达到OD600为0.375-0.4 （4）3）培养物转入2只50mL离心管中，冰上放置10分钟 ，4,000r/min, 4℃离心15分钟，弃上清（5）。4）将菌体悬浮于10～20mL预冷的0.1mol/L CaCl2 溶液中, 冰上放置20分钟(6)。5）4,000rpm, 4℃,离心10分钟，弃上清，然后将细菌轻轻悬浮在2ml 0.1mol/L CaCl2 溶液中（7）。若不立即进行转化实验，则进行第6步操作，反之，则进入转化操作。6）缓慢滴入甘油(灭菌)至终浓度为15％, 轻柔混匀，将细菌分装成0.5ml/每管，立即液氮冷冻，转入-70℃冰箱储存，可在2个月内使用（8）。 2、感受态细胞的转化1）设计好实验项目，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）；?? 2）从-80℃冰箱中取出分装成0.5mL/每管的感受态细胞, 置冰上5分钟或缓慢流水淋至刚好解冻（10） ，立即分装到预冷的1.5mL离心管中，每管体积参见上表，插入冰