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如何做原核表达之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是 国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年 的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建 有62个生产基地。Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达 系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。pET系列 载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理 见下图。T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的 元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的 转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因 的转录能达到很高的水平。T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚 合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是λ噬 菌体的衍生株，一段含有lac，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型， 类似于Lac表达系统。从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子 进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在 大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让 外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substanceA, NusA）。2. 转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。3. 插入一个定位到周质空间的信号序列。不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。如果你 不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，你也可以选择用Nde直接从 起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸 的酶切位点把多余的多肽切除。在重组技术上，Novagen除了传统的酶切、连 接方式外，还有不需要连接的克隆方式：Ligation-Independent cloning，简称LIC。采用LIC方法的pET载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计PCR扩增引物时 加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再 把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进 行表达。而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和 repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可 以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。 当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内 的拷贝数就可以增加到25-50。pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型， 在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是 将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的 菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步 抑制，质粒可以更稳定地存在。Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改 造，它们大致分为以下几个种类：1. 蛋白酶缺陷型 所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，这包 括有B834, BL21, BLR, Origami? B, Rosetta?和Tuner?。因此在 纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。BL21(DE3)是应用最多的 表达的表达菌株。另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是