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计算机在生命科学中的应用 硫磺矿硫化叶菌碱基片段进行引物扩增 前言：引物设计是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。 引物设计原则 1、长度：15—30bp，其有效长度一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。 2、G十c含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。 3、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。 4、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。 6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。 7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。 8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。 实验内容： 试验中用到古生菌的序列长12389bp，其中80-709bp是我们需要的未知功能蛋白质的基因序列。 实验步骤： 用不同的限制性内切酶处理，用琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，最后得到所需的的DNA片段，是理想的PCR模板。对目的基因所在片段进行分析，找到合适的引物及反应条件。使用PCR扩增得到目的DNA。首先我们要用限制性内切酶将多余的片段切去。找目的基因所在的片段。选择所需的载体,确定合适的酶切位点。所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点。根据引物设计原则，.选择合适的引物，进行PCR扩增，就得到大量目的DNA片段。 由上图酶切位点可以看出，第980个碱基处的两个酶切位点对目的基因所在的DNA序列进行酶切后电泳，结果如下： 由电泳结果可以看出，酶切后得到两条DNA片段，短的DNA片段即为目的基因所在片段。 由引物设计原则对以上引物进行分析得最优引物序列为： Contains region of the molecule from 80 to 832 Tm: 71.2 C TaOpt: 51.0 C GC: 29.7 Sense Primer: CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer without 5 attachment: 100.0% Length: 24 Tm: 53.7 C GC: 45.8 dH: -170.4 kcal/mol dS: -442.4 cal/mol dG: -36.7 kcal/mol Antisense Primer: GAATTC GCAGATTTCCAGACAGAA Similarity of primer without 5 attachment: 100.0% Length: 24 Tm: 56.4 C GC: 41.7 dH: -177.6 kcal/mol dS: -459.1 cal/mol dG: -38.9 kcal/mol Tm Difference: 2.6 GC Difference: 4.2 #2: Product of length 765 (rating: 171) Contains region of the molecule from 80 to 832 Tm: 71.2 C TaOpt: 51.0 C GC: 29.7 Sense Primer: CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer without 5 attachment: 100.0% Length: 24 Tm: 53.7 C GC: 45.8 dH: -170.4 kcal/mol dS: -442.4 cal/mol dG: -36.7 kcal/mol Antisense Primer: GAATTC AGCAGATTTCCAGACAGA Simila