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14 芯片基因组技术在突变分析和微生物检测中的应用 周集中 Dorothae K.Thompson 张晓君译 朱晨光初校，张晓君校 14.1 前言 DNA和寡核苷酸芯片为复杂核酸的检测提供了强有力的工具。芯片应用的两个主要方面是基因表达谱（例如，DeRisi等，1997；Wodicka等，1997）和遗传突变分析（Hacia，1999）。芯片基因表达谱产生整个基因组的数据，这在十年前是不可能的。以芯片进行遗传突变分析仍处于完善阶段，因此还没有很多文献报道。尽管还有很多困难，在遗传突变中，单核苷酸多态性（SNP）最适合于做芯片的靶（Broude等，2001）。而用芯片技术分析多点突变、插入、缺失和重排时遇到很大问题。 最近，芯片基因组技术已被扩展到检测自然环境中的微生物（见Zhou和Thompson，2002；Zhou，2003的综述）。尽管DNA芯片技术已在纯培养物的基因表达分析中得到成功的应用，但它在复杂环境样品中的应用还没有被深入地测试和评价。理论上，芯片基因组技术具有对复杂环境样品进行全面的定量化描述的优势。然而，改进的芯片杂交用于环境研究仍在专一性、灵敏度和定量化方面面临挑战（Zhou和Thompson，2002；Zhou，2003）。 本章简述芯片技术的原理以及芯片技术分析遗传突变和检测自然环境中的微生物的必威体育精装版进展。介绍了以芯片分析突变的各种方法，并描述了各类可用于分析环境样品的微生物群落结构的芯片。 14.2 寡核苷酸芯片用于突变分析 SNP是人类和其它自然或实验生物的基因组中最常见的一种类型的变异。据估计，每一千个染色体拷贝就有一个核苷酸的差异（Landegren等，1998）。SNP是突变分析的重要标记，因为它们往往位于我们感兴趣的位点附近或就位于其中，并且许多SNP或直接影响蛋白质的结构或影响基因的表达水平。另外，SNP的遗传很稳定。适当样品中的大量SNP的基因分型有助于理解疾病易感性和抗性、复杂遗传特性的差异以及人类进化的遗传变异基础(Hacia,1999)。由SNP引起的序列差异的定位、鉴定和分类是正常和疾病状态下遗传变异和表型变异的首要工作。然而，这项研究需要对数千样本的成千上万的SNP位点进行快速廉价大规模的序列分析。 已经建立和使用了很多种传统方法对SNP分型，如微测序、分子信标、寡核苷酸连接和5’核酸内切酶测定（Landegren等，1998；Hirschhorn等，2000）。尽管这些方法已成功地应用于小数目的SNP的分型，它们难以满足高通量、大规模的序列比较和突变分析。为有效地进行大规模的遗传研究，需要有高通量基因分型的方法。已经建立并测试了可以对大量的SNP分型的基于芯片的实验策略，即等位基因专一性的寡核苷酸探针差异杂交和芯片引物延伸测定（Hacia，1999）。本节简要描述每个实验策略的原理及其应用。 14.2.1 等位基因专一性寡核苷酸芯片杂交测定 用于检测基因组SNP的好方法的主要要求是能够在二倍体基因组中准确地区分纯合体与杂合体等位变异。以等位专一的寡核苷酸（ASO）探针进行差异杂交被广泛地用于芯片测定中（Yershov等，1996；Wang等，1998；Hacia，1999）。这种杂交测定依赖于短寡核苷酸与完全匹配或有错配的靶序列突变体杂交的稳定性的差异。然而，ASO分型的专一性强烈依赖探针特性与杂交条件。探针的设计对于获得专一的检测至关重要。 探针与矩阵设计 对完全匹配和单碱基错配DNA二倍体的杂交的区分依赖于稳定性的差异，而稳定性受探针特性与杂交条件的影响。对于大规模分析，最理想的是确定一套杂交条件能够对所有感兴趣的SNP进行有效的区分。这可以通过选择合适的ASO探针使之具有相近的解链温度，解链温度受控于探针长度、碱基组成和错配碱基在ASO中的位置。 探针长度是影响双链稳定性的关键因素。一般地，要获得最大分辨力，希望探针序列要短并具有较低的双链稳定性。而长探针形成更稳定的双链，它们由于错配序列的百分比降低而使分辨力降低。另外，靶样品的单链DNA的二级结构也影响探针长度的选择。在高盐条件下，单链DNA可在链内形成二级结构。如果这个结构的稳定性高于靶DNA和ASO探针之间形成的双链的稳定性，靶DNA的单链的杂交区就不能与芯片上探针杂交。这个问题可以通过选择较长的探针序列得到部分消除，长探针可以使杂交在较高的温度下进行。较高温度下进行杂交可以使靶DNA的单链内部二级结构解链。考虑所有这些因子，ASO探针需要设计成15到25个碱基长度（Guo等，1994；Hacia和Collins，1999）。 用12、15和20碱基的ASO探针测定了探针长度对专一性的影响（Guo等，1994）。所有探针产生大致相当的信号，而15碱基ASO探针获得最好的单碱基区分效果。12碱基ASO由于