活体发光技术进展..doc

活体生物发光成像技术的必威体育精装版进展(转) 活体动物体内光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。另外, 这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质和方法, 非常安全。 因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。 一、??技术原理 1.??标记原理 哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。对于细菌，lux操纵子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光，不需要外源性底物。 基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。标记细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术, 将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。目前, 常用的细胞株基本上都已标记好, 市场上已有销售。 将标记好的细胞注入小鼠体内后, 观测前需要注射荧光素酶的底物—荧光素，为约280道尔顿的小分子。荧光素脂溶性非常好, 很容易透过血脑屏障。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45分钟。每次荧光素酶催化反应只产生一个光子，这是肉眼无法观察到的，精诺真公司（Xenogen Corp.）生产的IVIS成像系统，应用一个高度灵敏的制冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软件，可观测并记录到这些光子。 2.??光学原理 光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用精诺真公司的IVIS系统最少可以看到皮下的500个细胞，当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。在相同的深度情况下, 检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。可见光体内成像技术的基本原理在于光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器量化检测到的光强度，同时反映出细胞的数量。 3.??实验过程??通过分子生物学克隆技术, 应用单克隆细胞技术的筛选，将荧光素酶的基因稳定整合到预期观察的细胞的染色体内，培养出能稳定表达荧光素酶蛋白的细胞株。 典型的成像过程是：小鼠经过麻醉系统被麻醉后放入成像暗箱平台，软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯拍摄第一次背景图。下一步，自动关闭照明灯, 在没有外界光源的条件下拍摄由小鼠体内发出的光，即为生物发光成像。 与第一次的背景图叠加后可以清楚的显示动物体内光源的位置，完成成像操作。之后，软件完成图像分析过程。使用者可以方便的选取感兴趣的区域进行测量和数据处理及保存工作。当选定需要测量的区域后，软件可以计算出此区域发出的光子数，获得实验数据。软件的数据处理和保存功能非常强大，可以加快实验速度，方便大批量的实验。 4．荧光成像功能 精诺真活体动物成像系统IVIS200具有内置荧光成像功能。 荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白DsRed 及其它荧光报告基团，标记方法与体外荧光成像相似。荧光成像具有费用低廉和操作简单等优点。 同生物发光在动物体内的穿透性相似，红光的穿透性在体内比蓝绿光的穿透性要好得多，近红外荧光为观测生理指标的最佳选择。 Xenogen的IVIS系统可检测波长范围400–950nm的荧光，通过六块不同的激发光滤镜获得所需的特定激发光波长。光线通过第二块蓝色漂移背景光滤镜（blue-shifted background filters），使得初始的激发光产生轻微的蓝色漂移