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第二章 基因操作的工具酶Enzymes 限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶 简称限制酶（Restriction enzyme）,是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在相关位置切割DNA双链的核酸内切酶。 1. 来源 原核生物 2. 性质 内切酶 即在核酸分子链的内部制造切口的酶 3. 功能 自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系） （1）限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。 （2）修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 二、限制性内切酶的分 类 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶 II 型限制性内切酶 III型限制性内切酶 核酸限制性内切酶的主要特性差异比较 特性 I型内切酶 II型内切酶 III型内切酶 限制和修饰活性 单一多功能的酶 内切酶和甲基化酶分开 共同亚基的双功能酶 内切酶的蛋白结构 3种不同的亚基 单一成分 2种不同的亚基 限制作用所需要的辅助因子 ATP、 Mg2+和SAM Mg2+ ATP、 Mg2+和SAM 寄主特异性位点识别序列 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC 回文序列 （IIs型除外） EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 切割位点 在距离识别位点至少数百 bp 位于寄主特异性位点或其附近 距寄主特异性位点3‘端24—26bp处 甲基化作用的位点 寄主特异性位点 寄主特异性位点 寄主特异性位点 识别未甲基化的序列进行切割 能 能 能 序列特异的切割 不是 是 是 基因工程中的用途 无用 十分有用 1. I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC （2）切割位点 在距离特异性识别位点400 bp 以上 （约1000—1500 bp） （3）作用机理 需Mg2 + 、 ATP和SAM（S-腺苷蛋氨酸） 2. III型限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 3. II类限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ （1）识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列。 与DNA的来源无关。 （2）切割位点 识别位点处 切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end） 三、限制性内切酶的命名 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： 1. 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的缩略语表示该酶来源的微生物的属名。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 四、 II型限制酶的特性与DNA的切割 1、基本特性 （1）识别序列呈回文结构 回文结构—序列呈180o旋转对称或二重互补对称，即同一条单链以中心轴对折可形成互补的双链。 （2）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ① 3’端凸出（如Pst I切点） ② 5’端凸出（如EcoR I切点） 粘性末端的意义 ①连接便利 i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接 这比连接两个平齐末端容易的多 ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 ② 末端标记 凸出的5’末端可用DNA核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平末端