第六讲基因克隆的质粒载体..doc

第六讲 基因克隆的质粒载体 吴 乃 虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2005年8月 基因克隆的质粒载体 一、导言 1．质粒是一类引人注目的亚细胞有机体 其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。 2．质粒的类型多种多样 F质粒：F因子或性质粒(Sex plasmid)，它能够使寄主染色体上的基因与F因子(F factor)一道转移到原先不存在该质粒的寄主受体细胞中去。 R质粒：通称抗药性因子(Resistant factor, R factor)，编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞中去。 Col质粒：所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素可使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。 3．质粒载体 70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。 二、质粒的一般特性 1．质粒DNA(细菌质粒定义) *1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。 *2.质粒DNA分子大小 文献中有3种说法：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD *3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系 一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。 *4.质粒DNA的分子构型 SC构型：即共价闭合环形的cccDNA所呈现的超螺旋构型。走在凝胶的最前面。 OC构型：即开环DNA(ocDNA)所呈现的构型，其中一条DNA链保持完整的环形结构，另一条链上则出现有一个至数个的缺口。走在凝胶的最后方部位。 L构型：发生双链断裂形成的线性DNA分子所呈现的构型，通称L型。走在凝胶中间部位。 2．质粒克隆载体必须具备的条件(三种共同的组成部分) ①具有复制区或复制因子(replicator) 复制因子： 是指一段特定的质粒DNA，它含有质粒DNA的复制起点(ori)(origin of replication)，以及编码质粒DNA和质粒复制所需要的DNA序列结构。 *注意 复制因子(replicator)和复制子(replicon)之间在概念上的差别。 复制子(replicon)：系指含有一个复制起始位点的DNA复制单位，例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA能够进行自主复制的遗传单元均称为复制子。 *在一般的情况下，一个质粒只含有一个复制起点，构成一个独立的复制子。但在少数的情况下，由融合产生的质粒也会含有两个复制子，但其中只有一个有活性。 ②具有抗菌素抗性基因 一种理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因，以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状作为选择记号，而且在有关的限制酶识别位点上插入外源DNA片段之后形成的重组质粒，至少仍要保留一个强选择记号。 ③具有若干限制酶单一识别位点 这样的分子结构特性，可以满足基因克隆的需要，而且在其中插入适当大小的外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。 ④具有较小的分子量和较高的拷贝数 这类质粒的优点在于： a.低分子量质粒易于操作，克隆了外源DNA片段之后(一般不超过15Kb)仍可有效地转化给受体细胞； b.含有较高的拷贝数有利于质粒DNA的制备，增加克隆DNA片段(基因)的产量； c.低分子量的质粒分子中对某种限制酶具多重识别位点的机率也就相应下降； 3．质粒DNA编码的表型 ①质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%。 ②质粒DNA尽管分子量 小，但却编码着重要的遗传性状： a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。 b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；……固N作用；H2S的合成；柠檬酸的利用；欧文氏菌的色素形成；产碱杆菌的反硝化活性；产碱杆菌和欧文氏菌的硫氨素的合成； c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；炭疽杆菌外