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《生化仪器分析》实验指导书 辽宁石油化工大学化学化工与环境学部 实验教学中心 目 录 实验一 紫外分光光度法测定维生素C含量实验二 气相色谱法测定醇的同系物实验三 原子吸收测定金属含量 实验一 紫外分光光度法测定维生素C含量 实验项目性质：验证所属课程名称：《生化仪器分析》 实验计划学时：6学时 一、目的要求： 1、理解紫外分光光度法的原理 2、掌握紫外可见分光光度计的结构、性能及使用方法3、掌握应用标准曲线进行定量分析的方法二、实验原理 紫外分光光度法(Ultraviolet Spectrophtometry)，又称紫外吸收光谱法( Ultraviolet Moleculor Absorption Spectrophtometry)，它是研究分子吸收190.0-1100.0nm波长范围内的吸收光谱。紫外吸收光谱主要产生于分子价电子在电子能级间的跃迁，是研究物质电子光谱的分析方法。通过测定分子对紫外光的吸收，可以对大量的无机物和有机物进行定性和定量测定。维生素C在紫外光区的最大吸收波长λmax=243nm。对Vc溶液进行扫描时，在243nm处有较强的吸收峰。 定性分析时，可在相同的条件下，对标准样品和未知样品进行波长扫描，通过比较未知样品和标准样品的光谱图对未知样进行鉴定。在没有标准样品的情况下，可根据标准谱图或有关的电子光谱数据表进行比较。 光的吸收定律即郎伯-比尔定律，定量的说明物质对光选择性吸收的程度与物质浓度及液体厚度之间的关系，是可见-紫外分光光度计定量分析的基础。 郎伯-比尔定律： 式中：A—吸光度；K—比例系数；C—吸光物质的浓度；b—溶液的液层厚度，即光线通过溶液的光程长度，它取决于吸收池的厚度。 定量分析是在243nm处测定不同浓度苯酚的标准样品的吸光值，并自动绘制标准曲线。再在相同的条件下测定未知样品的吸光度值，根据标准曲线可得出未知样中Vc的含量。 三 、实验仪器和药品 UV1100紫外可见分光光度计（带比色皿）、离心机、分析天平、容量瓶（100ml、25ml）；比色管（25ml）12个；吸量管（1ml、2ml、5ml）；研钵、吸耳球、玻璃棒、洗瓶。 10%HCl：133mL浓HCl，加水稀释至500mL。 1%HCl：取浓HCl 2.ml，加水稀释至100ml。 1mol/L NaOH溶液：称取40gNaOH，加蒸馏水，不断搅拌至溶解，然后定容至1000ml。 四、实验步骤 （一）吸收曲线的绘制 1、抗坏血酸标准溶液的配制：用分析天平准确称取抗坏血酸10mg，加2ml 10%盐酸，加蒸馏水定容至100ml，混匀。此抗坏血酸溶液的浓度为100μg/ml。 2、吸收曲线的绘制：用移液管取Vc标准溶液5ml于25ml的比色管中，稀释至刻度，摇匀，选用1cm石英比色皿，以蒸馏水为参比，在200—300nm波长范围内用紫外分光光度计自动扫描。绘出A—λ吸收曲线（每5nm记录对应吸光值），该曲线确定的最大吸收波长即为测定波长。 （二）标准曲线的制作 1、取样： 取带塞刻度试管8支并编号，分别按表内所规定的量加入抗坏血酸标准溶液和蒸馏水。 1 2 3 4 5 6 7 8 标准抗坏血酸溶液体积ml 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 2 2.5 蒸馏水ml 24.75 24.5 24.25 24 23.75 23.5 23 22.5 总体积ml 25 25 25 25 25 25 25 25 抗坏血酸溶液浓度μg/ml 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0 2、吸光值的测定 以蒸馏水为空白，在上面实验测定最大波长处测定标准系列抗坏血酸溶液的吸光值，以抗坏血酸的含量（μg）为横坐标，以相应吸光值为纵坐标作标准曲线。 （三）样品的测定 1、样品的提取 （1）青椒待测液：将青椒洗净、擦干、切碎、混匀。称取5.00g于研钵中，加入25ml 1%HCl，匀浆，转移到25ml容量瓶中，稀释至刻度、混匀。3500r/min离心10min，取上清液测定含量。 （2）橙子待测液：取橙肉5.00g于研钵中，重复上述操作。 2、待测样品 （1）待测青椒：取0.5ml青椒提取液，放入盛有1ml 10% HCl的25ml中，用蒸馏水稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为空白，在最大波长处分别测定其吸光值。 （2）待测橙子：取0.5ml橙子提取液，其他操作同上。测定吸光值。 3、待测碱处理液的制备 （1）碱处理青椒提取液：吸取0.5ml青椒提取液，5ml蒸馏水和2ml 1M NaOH溶液依次放入25ml中，摇匀；20min后加入2ml 10% HCl，混匀，并定容至刻度。以蒸馏水为空白