各类层析色谱技术完全讲解解读.ppt

层析技术 第一节 层析概述 层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 经典色谱（offline) 现代色谱（online) 层析技术的原理 层析系统都由两个相组成：一是固定相(不动的一相)，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相(携带样品流过固定相的流动体)，即可以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。 二、层析法的特点 分离效率高：复杂混合物、有机同系物、异构体、手性异构体。 灵敏度高：可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 应用范围广 不足之处：被分离组分的定性较为困难。 层析应用范围 凡是溶于水和有机溶剂的分子和离子，在性质上有一定差异均可通过层析方法进行分离。 分离的范围包括： 无机化合物：无机盐类、无机酸类、络合物类等 有机化合物：烷烃类、有机酸和有机胺类、杂环类 生物大分子：核酸和核苷酸类、蛋白质、酶及肽类、多 糖及寡糖类、激素类 活体生物： 病毒、细菌、细胞器等 分析的参数 常见的层析分离法分析技术，是以混合物中分离单一成分，制备一定量的产品为主，以分析鉴定化合物的性质，获得分析参数为辅。 HPLC以分析为主。 通过层析方法可以对物质进行一定程度的定量、定性和纯度鉴定。 纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之分离。 纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单，操作比较容易，重现性好。 三、层析前蛋白质处理 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。 1、盐析法 盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。 2、等电点沉淀 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。 3、有机溶剂沉淀 降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀； 有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。 四、层析基本操作过程 1、柱层析的L/d比值 2、洗脱装置 改变溶剂系统 改变溶剂系统 3、结果检测 活性检测 比活没有提高 目的蛋白与杂蛋白并没有分开 比活有所提高，但总活性回收很低 目的蛋白有损失或有失活现象 测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性 结果保存 薄层层析纸层析 照相保存or 扫描仪转为图形or 积分仪变成数据 柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理 4、层析装置的仪器化 HPLC 概况 分离范围： 无机化合物 有机化合物 生物大分子 活体生物 应用范围： 大规模生产 小型制备、微量分离 定性定量分析 液相层析仪 填充技术 介质的预处理：溶胀、漂洗、再生、转型、脱气等 湿法填充：搅拌悬浮，自然沉降。 填充质量 检测器 紫外检测器 荧光检测器 折光检测器 电导检测器 固定相 固定相是不溶于溶剂和水的固定化颗粒，又称为层析介质、层析填料、填充剂等。 包括： 无机材料：硅胶，氧化铝 有机材料：聚苯乙烯等 多糖类材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺 层析介质与生物大分子的关系 大孔径的，亲水性好的球形材料。 多糖类凝胶层析介质最常用 Sephadex Sepharose Bio-Gel 缺点：刚性差，不耐压