微生物的接种和移种.doc

实验1 微生物的接种和移种 一．实验目的 1.明确无菌操作在接、移种操作中的重要性。 2.能采用不同接种工具独立进行接、移种操作。 微生物接、移种操作是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。无菌操作是微生物接、移种操作的关键。由于培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。因此，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作。由于接、移种方法不同，采用的接种工具也有区别，如固体斜面培养体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等。 二 实验条件及器材 1 无菌室的准备 在微生物实验中，一般小规模的接、移种操作，使用无菌接种箱或超净工作台；工作量大时使用无菌室接种，要求严格的在无菌室内再结合使用超净工作台。 1.1 无菌室的设计 无菌室的设计可因地制宜，但应具备下列基本条件： ⑴无菌室要求严密、避光，隔板以采用玻璃为佳。但为了在使用后排湿通风，应在顶部设立百叶排气窗。窗口加密封盖板，可以启闭，也可在窗口用数层纱布和棉花蒙罩。无菌室侧面底部应设进气孔。最好能通入过滤的无菌空气。 ⑵无菌室一般应有里外两间。较小的外间为缓冲间，以提高隔离效果。 ⑶无菌室应安装拉门，以减少空气流动。必要时，在向外一侧的玻璃隔板上安装一个双层的小型玻璃橱窗，便于内外传递物品，减少进出无菌室的次数。 ⑷室内应有照明、电热和动力用的电源。 ⑸工作台台面应抗热、抗腐蚀，便于清洗消毒。可采用橡胶板或塑料板铺敷台面。 1.2 无菌室内的设备 ⑴无菌室的里外两问均应安装日光灯和紫外线杀菌灯。紫外灯常用规格为30W，吊装在经常工作位置的上方，距地高度2.0～2.2m。 ⑵缓冲间内应安排工作台供放置工作服、鞋、帽、口罩、消毒用药物、手持式喷雾器等，并备有废物桶等。 ⑶无菌室内应备有接种用的常用器具，如酒精灯、接种环、接种针、不锈钢刀、剪刀、镊子、酒精棉球瓶、记号笔等。 1.3 无菌室的灭菌 ⑴熏蒸 在无菌室全面彻底灭菌时使用。先将室内打扫干净，打开进气孔和排气窗通风干燥后，重新关闭，进行熏蒸灭菌。常用的灭菌药剂为福尔马林(含37％～40％甲醛的水溶液)。按6～10ml／m3的标准计算用量，取出后，盛于铁制容器中，利用电炉或酒精灯直接加热(应能随时在室外中止热源)或加半量高锰酸钾，通过氧化作用加热，使福尔马林蒸发。熏蒸后应保持密闭12h以上。由于甲醛气体具有较强的刺激作用，所以在使用无菌室前1～2h在一搪瓷盘内加入与所用甲醛溶液等量的氨水，放入无菌室，使其挥发中和甲醛，以减轻刺激作用。除甲醛外，也可用乳酸、硫磺等进行熏蒸灭菌。 ⑵紫外灯照射 在每次工作前后，均应打开紫外灯，分别照射30min，进行灭菌。在无菌室内工作时，切记要关闭紫外灯。 ⑶石炭酸溶液喷雾 每次临操作前，用手持喷雾器喷5％石炭酸溶液，主要喷于台面和地面，兼有灭菌和防止微尘飞扬的作用。 1.4 无菌室空气污染情况的检验 为了检验无菌室灭菌的效果以及在操作过程中空气的污染的程度。需要定期在无菌室内进行空气中杂菌的检验。一般可在两个时间进行：一是在灭菌后使用前，一是在操作完毕后。 取牛肉膏蛋白胨琼脂和马铃薯蔗糖琼脂两种培养基的平板各3个，于无菌室使用前(或在使用后)，在无菌室内揭开，放置台面上，半小时后重新盖好。另有一份不打开的作对照。一并放30℃下培养，48h后检验有无杂菌生长以及杂菌数量的多少。根据检验结果确定应采取的措施。 无菌室灭菌后使用前检验时，应无杂菌。如果长出的杂菌多为霉菌时，表明室内湿度过大，应先通风干燥，再重新进行灭菌；如杂菌以细菌为主时，可采用乳酸熏蒸，效果较好。 2 接、移种工具的准备 最常用的接种或移植工具为接种环。接种环供挑取菌苔或液体培养物接种用。环前端要求圆而闭合，否则液体不会在环内形成菌膜。根据不同用途，接种环的顶端可以改换为其他形式如接种针等。 玻璃刮铲是用于稀释平板涂抹法进行菌种分离或微生物计数时常用的工具。将定量(一般为0.1ml)菌悬液置于平板表面涂布均匀的操作过程需要用玻璃刮铲完成。 移液管吸管的准备：无菌操作接种用的移液管常为lmL或10mL刻度吸管。吸管在使用前应进行包裹灭菌。 3 仪器设备、材料和工具的准备 3.1菌种：酵母菌斜面保藏菌种。 3.2培养基：基本培养基（YPD培养基、马铃薯葡萄糖培养基）。 3.3器材：超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，接种环、接种针、玻璃刮铲、刻度吸管、培养皿、三角瓶、试管、酒精灯、不锈钢刀、剪刀、镊子、酒精棉球瓶、记号笔等。 三 实验内容 1斜面接、移种操作 斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下： ⑴贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名