细胞培养的应用.doc

第十章 细胞培养的应用 第一节 细胞培养在分子生物学中应用 分子生物学是在生物化学、遗传学、免疫学、微生物学、细胞生物学、生物物理学等学科结合的基础上，经过相互杂交、相互渗透融合发展起来的一门新兴学科，它从分子水平上研究生命现象的本质以及活动规律，以达到造福人类的目的，主要侧重于研究基因的结构和功能、分子间信号传递和调控。 基因在细胞中的表达在时间和空间上具有高度的特异性；细胞的运动、迁徙、粘着、分化的控制机制需要从分子水平上阐明；肿瘤的发生和发展的机制有待于深入研究；人类基因组计划已于2000年６月完成人类基因组草图，科学家发现人类基因数目约为3万个左右，仅比果蝇多２万个，远少于原先10万个基因的估计。2003年4月14日，国际人类基因组测序组织正式对外宣布：美、英、日、法、德和中国科学家经过13年努力共同绘制完成了人类基因组序列图，人类基因组计划的所有目标均已实现。目前基因功能比较清楚的有10 000条左右，还有大量的基因功能不明；基因的功能需要以细胞为载体，细胞为这些研究提供了研究的对象和材料。 鄂征等将以研究体外培养的细胞为主要研究对象的分子生物学技术，称为分子细胞学技 术。细胞是由多种生物大分子如核酸、蛋白质、类脂等组成并由它们行使各种功能活动，只有通过对它们的研究，才能了解细胞的基本活动规律。 对其的研究技术可以分为三类，一是分离提取研究；二是基因导入研究；三是原位检测研究。 一、分离提取研究 根据分离物质的种类分为DNA提取、RNA提取、蛋白质提取。 1．DNA提取 在分子生物学研究中，DNA是这些技术应用的主要对象，所以从真核细胞中分离DNA是分子生物学研究中很重要的基本技术，DNA样品的质量直接关系到实验成功与否。真核细胞95％的DNA存在于细胞核中，DNA与蛋白质结合在一起，构成染色质的高级结构，另有5％存在于细胞器（线粒体）中。提取DNA的方法比较多，但基本原理是一样的，即去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类生物大分子，去除其他不必要的核酸分子，沉淀DNA，去除盐类、有机溶剂等杂质，最后纯化核酸。 方法一：酚抽提法 【材料】 磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4），DNA抽提缓冲液，10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），0.1mol/L ED-TA（pH8.0），20μg/ml RNase A，0.5％SDS，蛋白酶K 20mg/ml，酚（Tris-C1 pH8.0，饱和），NH4Ac 10mol/L，TE（10mmol/Tris-Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）），无水乙醇。 【操作过程】 （1）收集细胞，对于悬浮培养的细胞可以直接经1500g离心，用PBS洗涤一次，再次离心去上清；对于贴壁培养的细胞，用胰酶消化后再离心收集，用PBS液洗涤一次后，再次离心，弃上清，收集细胞。 （2）在有细胞沉淀的离心管中加入DNA抽提缓冲液l0ml，37℃ 1小时。 （3）加入50μl 20mg/ml的蛋白酶K，50℃保温3小时。 （4）加入等体积的酚，上下颠倒混匀，直至水相与酚相混匀成乳状液。 （5）室温，5000g离心15分钟，将水相转移到另一离心管中，重复酚抽提二次。 （6）转移水相，加入0.2倍体积的10mol/L NH4Ac，2倍体积的无水乙醇混匀，可立即看到乳白色丝状沉淀，弃去上清，立刻用70％乙醇漂洗沉淀。 （7）室温，5000g离心5分钟，弃上清，室温让乙醇挥发干净。溶于适量的TE中。 （8）测定DNA的含量和纯度。 【注意事项】 （1）此法可以用于提取5107个细胞，可得产量为200μg。 （2）高分子量DNA提取过程中，取上层DNA，往往会牵动水相与酚相的界面蛋白质层，可以将Tip头剪去一段，这样尖端的口径增大，缓慢吸取水相。 （3）在DNA抽提缓冲液中加入高浓度的RNase A，可以省去DNA沉淀后再次用RNaseA消化残留的RNA。 （4）此方法可分离100200kb左右的基因组DNA，适用于λ噬菌体作为载体的基因组文库的构建、脉冲场电泳、酶切分析、Southern杂交、PCR检测等实验。 方法二：甲酰胺解聚法 【材料】 DNA抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-C1（pH8.0），0.1mol/L EDTA（pH8.0），20μg/ml RNase A,0.5％SDS。蛋白酶K 20ml。变性缓冲液：80％去离子甲酰胺，0.8mol/L NaCl，20mmol/Tris-C1（pH8.0）。透析液1：0.1mol/L NaCl，20mmol/L Tris-Cl（pH8.0），l0mmol/L ED