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? 南宁科迪技术讲座之MicroRNA Northern Blot for microRNA * MicroRNA简介 MiRNA的检测方法 northern blot流程 1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色 步骤1 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN, Inc) TRIzol total RNA isolation 1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色 OD (optical density ) OD260 OD280 OD230 OD260/OD280: 1.8-2.0 OD260/230 2.0 步骤1 10 ug RNA + 2X loading buffer Incubated at 65℃ for 10min. On ice for 1min. Acrylamide Gel 步骤2 1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色 （1）配制15%的尿素变性PAGE胶，先用0.5XTBE，60V预跑30min。 （2）将样品与RNA loading buffer按比例混合，70℃预热5min，立即放置冰上。 （3）上样前，用缓冲液冲洗点样孔，防止点样孔中的杂质影响电泳。 （4）点样时，使样品均匀铺在点样孔底部或者使用微量进样器直接在靠近点样孔底部的位置点样。 （5）冰浴中，恒压60-80V电泳约1.5h，至溴酚蓝指示带距底部约3cm处。 步骤2 （1）电泳结束后，取出凝胶，浸入预冷的0.5XTBE缓冲液中。 （2）转膜所用的膜以及滤纸也需用0.5XTBE缓冲液浸湿。 （3）组装“三明治”，从负极到正极依次为：滤纸、胶、膜、滤纸。 （4）组装转膜装置，确保装置所有正负极都连接正确。 （5）冰浴中，恒压60V转膜约1h。 步骤3 1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色 步骤4 （1）转膜后，用紫外交联仪固定膜， 42℃干燥15min。 （2）加入4ml 预热的预杂交液，42℃旋转30min。 （3）倒掉DIG easy hyb ，加入含探针杂交液（探针用预杂交液稀释至25ng/ml）。 （4）在39-42 ℃温度下，杂交过夜。 （5）杂交后的膜在室温用washing buffer漂洗2遍。 步骤5 1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色 1. 杂交后的膜用10ml washing buffer在室温漂洗膜。 2. 用10ml blocking solution进行室温封闭1h。 3. 用10ml antibody solution 进行室温孵育2h。 4. 10ml washing buffer漂洗膜次，每次5min。 5. 再用ECL显色法显色。 步骤6 1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色 ? 南宁科迪技术讲座之MicroRNA