酪氨酸酶化学修饰动力学-厦门大学学报（自然科学版）.docVIP

硫代硫酸钠对酪氨酸酶的抑制作用 芶 琳1* 卢 航2 王西瑶3 刘晓倩3 1. 四川农业大学生命科学院,四川成都 611130; 2. 四川农业大学风景园艺学院,四川成都 611130; 3. 四川农业大学农学院,四川成都 611130. 摘 要： 目的：酪氨酸酶是生物形成黑色素的关键酶，该酶抑制剂对果蔬防褐和色素沉着性疾病具有重要的应用前景。在筛选酪氨酸酶抑制剂时，发现硫代硫酸钠对酪氨酸酶有抑制作用。方法：采用酶动力学方法研究硫代硫酸钠对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活力的抑制效应。结果：硫代硫酸钠对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶均有抑制作用。对单酚酶表现为降低酶稳定态活性，延长酶促反应迟滞时间；对二酚酶活力的抑制表现为浓度依赖关系，其抑制酪氨酸酶活力下降50%的抑制浓度(IC50)为8.80mmol/L。动力学分析，硫代硫酸钠对酪氨酸酶的抑制作用为可逆非竞争性抑制，其抑制常数为0.5674mmol/L。结论：硫代硫酸钠可有效的抑制酪氨酸酶的活性，作为已知的小分子，硫代硫酸对酪氨酸酶的抑制作用，可为酪氨酸酶抑制剂的设计和开发应用提供理论基础。 关键词：硫代硫酸钠；酪氨酸酶；抑制作用 酪氨酸酶(EC 1．14．18．1)是一种含铜的金属氧化酶，广泛分布于生物体内，具有多重生物学功能，可催化L-酪氨酸羟化生成L-多巴，还可催化L-多巴氧化生成多巴醌，兼有单酚酶和二酚酶的活性，多巴醌再进一步反应则可形成黑色素[1-2]。酪氨酸酶是生物体黑色素合成的关键酶，昆虫抗紫外线，果蔬褐变以及人体色素沉着性疾病都与酪氨酸酶的表达和活性密切关[3-6]。抑制酪氨酸酶的活性，有助于控制生物体黑色素的生成。因此，酪氨酸酶抑制剂的筛选受到了国内外学者的广泛关注。酪氨酸酶抑制剂不仅能作为化妆品中的美白成分以及防止果蔬褐变等，还可用于人体色素沉着性疾病药物的研发。关于酪氨酸酶抑制剂的研究已有较多的报道，杜志云等[7]报道了姜黄素类化合物及其衍生物作为酪氨酸酶抑制剂。陈清西等人测定了曲酸[8]、3,5-二羟基二苯乙烯[9]、甘醇酸[10]、苯甲酸[11]和VB1[12]等对酪氨酸酶的抑制作用。汲逢源等[13]的研究表明，培养基中加入硫代硫酸钠等抗氧化剂能有效地抑制大豆下胚轴在组培过程中褐化发生。我们以酪氨酸酶为靶酶筛选该酶的抑制剂时，则发现硫代硫酸钠（Sodium thiosulphate Na2S2O3）对酪氨酸酶有抑制作用，且未见相关报道。本文以硫代硫酸钠作为效应物, 研究其对酪氨酸酶的抑制作用，分析其量效关系，并结合酶动力学方法研究硫代硫酸钠对酪氨酸酶的抑制机理，以期为酪氨酸酶抑制剂分子设计和实际应用提供理论依据。 1. 材料与方法 1.1 材料 蘑菇酪氨酸酶（tyrosinase, specific activity 1000 unit/mg）、L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)购自Sigma公司；L－酪氨酸（Ｌ-Tyr）购自Aldrich化学公司；硫代硫酸钠(sodium thiosulfate, Na2S2O3)、磷酸盐等试剂均为国产分析纯。UV-1240 型紫外可见分光光度计：SHIMADZU公司。 1.2 方法 1.2.1 硫代硫酸钠对酪氨酸酶单酚酶的影响 单酚酶活力测定[14]，以L－酪氨酸为底物，在含有不同浓度的硫代硫酸钠溶液中，加入酪氨酸酶（终质量浓度为32ug/mL），30℃下，测定波长为475nm的吸光值随时间的增长曲线。曲线呈直线关系后即达到酶促反应的稳定态，此时直线的斜率即为酪氨酸酶单酚酶稳定态活力，而直线与横轴的交点则为酶促反应的迟滞时间。 1.2.2 硫代硫酸钠对酪氨酸酶二酚酶的影响 酪氨酸酶二酚酶活力测定参考文献[15]。酶活测定体系为1 mL, 在50mmol/L pH6.8磷酸盐缓 冲液中，以2mmol/L L-DOPA为底物，加入10uL 0.4mg/mL酪氨酸酶溶液，立即混匀，30℃恒温条件下，测定492nm波长的吸光值，以每分钟吸光值的变化表示其酶活性。 硫代硫酸钠对酪氨酸酶二酚酶的影响，以L-DOPA为底物，加入不同浓度硫代硫酸钠溶液（由50mmol/L，pH6.8磷酸盐缓冲液配制的硫代硫酸钠溶液），其它条件同上，L-DOPA终浓度为2mmol/L，磷酸盐缓冲液终浓度为50mmol/L，pH6.8，最后加入10uL0.4mg/mL酪氨酸酶溶液，492nm波长下测定酶的活力。 1.2.3 硫代硫酸钠对酪氨酸酶二酚酶抑制动力学测定 在上述酶测活体系中，L-DOPA浓度不变，改变酶浓度，测定不同浓度的硫代硫酸钠对酪氨酸酶活力的影响。测定酶促反应速度与酶浓度的关系，根据其相关性来判断硫代硫酸钠对酪氨酸酶二酚酶活力的抑制是否可逆． 硫代硫酸钠与酪氨酸酶抑制类型测定，则在含有不同浓度硫代硫酸钠的测活