细胞基因分离鉴定和原位杂教材分析.docVIP

第20章 细胞基因分离鉴定和原位杂交 第一节 细胞DNA、RNA的分离鉴定技术 一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定 人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase处理和纯化来提取DNA，可用于细胞凋亡中对所引起DNA断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍了有关DNA的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的DNA还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。 (一)DNA提取方法： (1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。 (2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K至终浓度为0.5～1arkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。 (3)50℃水浴2小时，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DNA断裂，约3分钟。 12000r/min离心15分钟（室温） (4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质 12000 r/min离心15分钟（室温） (5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次 (6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀 12000 r/min离心15分钟（室温） (7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时 12000 r/min离心15分钟（室温） (8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。 (9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。 (10)加入蛋白酶K至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入Nace至终浓度10mmol/L。 (11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。 (12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。 (13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃ 1小时。 (14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。 (二)DNA纯度检测及含量计算 DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于1.75.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。 取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8 OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA，故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀释倍数。 DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL) DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。 二、培养细胞总RNA的提取及鉴定 细胞中含有三类RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源，是蛋白质合成的场所,有特殊意义,不同的细胞所表达某种蛋白的mRNA的种类和产量是不同的，为了提高细胞转录的mRNA的种类和产量，通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。 提取细胞总RNA的方法，常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞，我们在细胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法，但不纯，本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，可利于提取总RNA，也可从总RNA中提取mRNA，从而分析mRNA表达量，建立cDNA文库，以及对mRNA的调控和进行反义RNA研究。 变性液：7mol/L盐酸胍，25m mol/L棕檬酸钠pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巯基乙醇。 水平衡酚：在饱和酚中加入等体积DEPC处理的三蒸水(或新鲜无菌的三蒸水)混匀后去除水相，再重复处理二次即可。 所用玻璃、塑料制品、金属器材可用0.1% DEPC水浸泡过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用180℃干烤6小时，以去除被污染的RNA酶。 (一)总RNA的提取方法： 1、消化收集细胞方法同前。