【2017年整理】WB试验注意事项微信.doc

Western Blot试验2014-05-07? HYPERLINK javascript:viewProfile(); 医学生学术（MSA）Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎。 一、配胶 这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外)，过滤后作为储存液避光存放于4 ℃PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵(AP)一定要新鲜——最好用小指管配AP(写日期)保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度10%时可用0.1%的SDS封，浓度10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴10%的AP最好现配现用，如在4 ℃过硫酸铵(APS)(10%;w/v)取3 g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30 mL。此溶液4 ℃但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。二、样品处理先制备蛋白样品，后灌注压缩胶，压缩胶灌注后应在20~40 min内使用。上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer(别小气，重复使用会降低缓冲能力的)，好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1. 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。2. 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。3. 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。4. 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(建议加入合适的蛋白酶抑制剂) 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80 ℃三、电泳所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积低电压短时间的预电泳(恒压10-20 V,20-30min)，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通以初始电压为45 V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，四、转膜由于转膜过程中的气泡问题对于实验结果有很大的影响切记：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许气泡存在。将PVDF膜先在甲醇中浸泡几分钟,再转移到转膜缓冲液中处理15min。PVDF膜，125-200 ug/cm2(适合于SDS存在下与蛋白质的结合)另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%(据说0.05%效果最好)PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理(不超过15秒)再用缓冲液平衡，才能用如果WB前没有可参考的资料——比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件(稀释度)，可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂;切个小角是常用的方法。膜上要做好标记，识别正反面和上下膜彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的半干电转移要防止过热转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好切记。封闭时间和封闭剂的量都要足够。封闭不完全，后面就全白忙活了五、封闭及杂交可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS变性