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* * * * * * * 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 快开矿 博学笃行 尚德济世 主讲人: 绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆、表达及粗提取 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 绿色荧光蛋白简介 1.一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白 2. GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr 3.1962 年,下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素,并发现这种绿色的荧光蛋白。1974 年,他们分离得到了这个蛋白 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 绿色荧光蛋白优点 ①荧光强度高,稳定性高; ②分子量小,易于融合,适用于多种转化方式,对受体无毒害,安全可靠; ③不需要反应底物与其他辅助因子,受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测; ④不具有种属依赖性,在多种原核和真核生物细胞中都表达; ⑤通过替换一些特殊氨基酸,可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域 1.仪器:恒温培养箱,超净台,恒温摇床,制冰机,台式离心机,核酸电泳仪,小型混合器,冰箱,蓝盾可见光透射仪,移液器、电泳槽、振荡器、制冰机、凝胶成像仪,水浴锅,高压灭菌锅、振荡培养箱,手持式紫外灯 2.试剂:BamH I;NotI(10U/μL);T4 ligase;LB培养基;溶液Ⅰ;溶液Ⅱ;溶液Ⅲ;TE缓冲液;20×TBE;GeneFinder-溴酚蓝上样缓冲液 ;1×TBE缓冲液 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 仪器与试剂 研究背景 研究思路 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 1.质粒DNA的分离与纯化 01 质粒DNA的分离与纯化 02 酶切及连接 03 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 04 GFP蛋白的诱导表达. 05 绿色荧光蛋白的粗提取 步骤一 步骤二 步骤三 步骤四 步骤五 主要步骤 1.1细菌的生长和质粒的扩增 1.2碱提取法 1.3质粒DNA的提纯 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 1.质粒DNA的分离与纯化 ? 2.酶切及连接 双酶切 1 质粒酶切产物的鉴定 2 回收酶切产物 3 连接 4 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 2.1双酶切 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 反应物(μL) pEGFP-N3 pET-28a 质粒 18 18 BamH I 2 2 Not I 2 2 10×buffer K 3 3 0.1%BSA缓冲液 3 3 ? 2.4 连接 目录 contents 研究现状 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 反应物 体积/μL 回收纯化的pET-28a质粒 5 gfp基因片段 12 T4连接酶 1 缓冲液(10×) 2 DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键,这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH),和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P) 3.1感受态细胞的制备 (CaCl2法) 3.2转化涂板 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 3.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 4.GFP蛋白的诱导表达 1.IPTG(异丙基硫代β-L半乳糖苷)是一种常见的诱导基因表达的诱导剂,结构类似乳糖。 2.GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点(MCS),GFP基因的表达受其上游T7启动子和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。 紫外灯下的绿色荧光蛋白 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 4.GFP蛋白的诱导
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