耐盐的地衣芽孢杆菌WX-02的分离及氯化钠在产量和分子水平对聚谷氨酸的别构调节教材分析.docVIP

应用生物化学生物℃的条件下使用带有R20V转子的Himac CR21G离心机（日本，东京，日立）将从液体培养基中分离的细胞进行离心。细胞干重是通过在80℃的条件下把细胞进行风干到一定的恒量来测定的。 聚谷氨酸的提纯 聚谷氨酸的提纯和重新获得是根据Do等人的方法来操作的。在液体培养基的PH值下降到3时将被分离的细胞在9540个重力单位的条件下使用带有R20V转子的Himac CR21G离心机离心15分钟。上清液用NaOH溶液中和，倒入4升的乙醇中，然后在4℃条件下混合并保存12小时，接着在9540个重力单位下离心10分钟。沉淀溶于蒸馏水中，其他不溶的成分通过在13700个重力单位下离心10分钟去除。聚谷氨酸（分子量降低为3500）原溶液通过在蒸馏水中渗析24小时然后冻干用来制备纯净的聚谷氨酸。 聚谷氨酸的测定 聚谷氨酸根据报道的方法进行分析[18,19]。纯净聚谷氨酸可以在6 mol/L HCl和110℃的条件下24小时能水解。水解液用6 mol/L NaOH中和，水解液中大量的谷氨酸盐是由安捷伦1100高效液相色谱仪(25 cm×4.6 mm, 美国安捷伦技术有限公司）利用C18硅胶进行测定的。10毫摩尔每升KH2PO4加上5.0%甲醇（PH2.5）作为流动相，流速为1.0 ml/min。以规范的标准通过一定保留时间，谷氨酸盐被证实是水解液中唯一的产物，聚谷氨酸的产量就是谷氨酸的量。 聚谷氨酸分子大小的估算 聚谷氨酸的分子大小是通过琼脂糖凝胶电泳来估算的[20]。少量纯净的聚谷氨酸（10ul)用TAE电泳缓冲液[40mmol/L三异丙醇胺 属性 表征 属性 表征 革兰氏染色 + D-木糖产酸 + 形状 2-3*0.8-1um 甘露醇产酸 + 孢子形状 + 葡萄糖产气 - 能动性 + 氨酸降解 - 硝酸还原作用 + 苯丙氨酸降解 - 厌氧生长 + 产尿素 + 水解淀粉 + 形成吲哚 + 水解酪蛋白 + 过氧化氢试验 + 水解凝胶 + NaCl（12%）生长 + VP测试 + PH8.0生长 + 利用柠檬酸 + PH5.7生长 + 利用丙酸 + 30℃生长 + D-葡萄糖产酸 + 50℃生长 + L-阿拉伯糖产酸 + 55℃生长 - +：正反应 -：负反应 NaCl浓度对聚谷氨酸产量的影响 NaCl浓度在最大聚谷氨酸浓度时对细胞干重，聚谷氨酸的容积得率和单位生物量生产率的影响是通过不同浓度的NaCl浓度在ME培养基上培养来研究的。如表2所示，尽管细胞生长降低，但聚谷氨酸的产量却随着NaCl浓度的升高而升高。 当氯化钠浓度为8%能得到最高产量为13.86g/l，和没有加氯化钠的培养基相比产量增加了5.28倍。据我所知，目前还没有有关耐盐性地衣芽孢杆菌产聚谷氨酸的报告，所以耐盐的WX-02菌株是地衣芽孢杆菌中第一个产聚谷氨酸的菌株。 尽管耐盐性的B微生物可以在含有25%氯化钠的培养基中生长，但是当氯化钠浓度从0.5%上升到5%聚谷氨酸的产量将下降29.5%，说明氯化钠对耐盐性的的B细菌在产聚谷氨酸的过程中有抑制作用。 图1 系统树是通过测定16S rDNA的序列来确定与WX-02菌株（编号EU564336）关系相近的生物体而建立的。插入的数字是出版序列的登录号。支持率是建立在1000次重复试验的基础上。系统树是通过临近结合的方法建立的。置换一个核苷酸在该图上的比例尺长度为0.01。 表格2 氯化钠对分批培养物中单位生物量的细胞干重、聚谷氨酸的收益率及生产率(YP/X)的影响 氯化钠浓度（%） 细胞干重(g/l) 聚谷氨酸产率（g/l） YP/X（g/g） 0 3.42±0.22 2.16±0.09 0.61±0.03 2 3.3±0.15 2.93±0.23 0.83±0.08 4 3.21±0.13 5.20±0.14 1.64±0.04 6 3.04±0.16 11.20±0.27 3.85±0.02 8 2.82±0.15 13.56±0.24 4.81±0.01 10 1.79±0.05 12.49±0.22 6.69±0.11 在烧瓶培养中在培养基中加入不同浓度的氯化钠浓度（0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%），分别测出细胞干重和聚谷氨酸产量，得到最大浓度的聚谷氨酸产量。 YP/X=每克细胞产生的聚谷氨酸克数。结果是三个分离发酵数据的平均数。 因此，地衣芽孢杆菌WX-02和B细菌的产聚谷氨酸量受氯化钠的影响是不同的。我们认为地衣芽孢杆菌WX-02具有处理高盐条件的抑制作用的潜能，可作为聚谷氨酸的工