1、GST-融合蛋白实验.ppt

蛋白质功能分析技术 徐 炎 10-21-09 一、Western blot: 二、免疫荧光技术： 三、免疫组织化学技术： 四、蛋白质与蛋白质相互作用研究： 1、GST-融合蛋白实验； 2、蛋白质免疫共沉淀技术： 3、酵母双杂交技术： 4 Gel filtration: 5、蛋白质芯片技术： SDS电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影。 3 注意的问题 （1） 蛋白质电泳 常用SDS：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。 （2）转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致 以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择 转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率。 （3）封闭 用5％脱脂奶粉或3％BSA （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制） 时间：室温2h或4oC过夜 （4）显色或显影 显色 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次 曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定 （5）膜的再利用 化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer洗涤后（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的? －2ME ） 用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次。 碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交。 （6）大量PVDF膜纯化抗体 1) 用无水甲醇浸润PVDF膜。 2) 将纯化好的包涵体抗源蛋白直接点在膜上或者将包涵体溶于8M尿素中以后点在膜上。（注意：蛋白浓度应达到约为0.1 mg/cm2） ?或者：跑蛋白电泳后将蛋白转至PVDF膜，用丽春红染色以后，切下目的蛋白条带。 3）在垂直混合仪上，用Glycine buffer处理膜5分钟 4）1? TBS缓冲溶液清洗膜两次, 每次五分钟 5）BSA Blocking Reagent对PVDF膜进行封闭一小时。 6）1? TBS缓冲溶液清洗PVDF膜两次,每次两分钟。 7）将待纯化血清用1? TBS缓冲溶液稀释4倍，加入封闭过的PVDF膜室温孵育2-3小时,或者4度过夜。（这一步最好把PVDF膜切为小块以保证最大的结合效率。可考虑加入100 μl 粗血清/ cm2 PVDF膜） 8) 保留上清, 室温下用1? TBS缓冲溶液清洗PVDF膜两次, 每次两分钟。 9) 洗脱: Glycine buffer与PVDF膜室温孵育两次，每次10分钟。合并洗脱液, 每1 ml洗脱液加Neutralization Buffer 30-40ul起中和作用, 尽快使最后的溶液pH值达到中性。 10) 通过Western Blot检查抗体的纯度和适合的工作浓度以后, -80度贮存纯化的抗体。或者，加甘油至浓度50%, -20度储存纯化的抗体。 二 、免疫荧光技术 利用某些荧光素，通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。 1.什么是FRET？FRET就是采用非放射性方法，在供体和受体相互靠得很近（1-10 nm）时，将光子能从一个受激励的荧光团（供体）转移到另一个荧光团（受体）。 采用FRET，可以解决超过光学显微镜光学显微限度的分子相对邻近度问题，来显示（例如）（1）二个蛋白质成分间分子相互作用；（2）一个分子内部（如酶活动能力、DNA/RNA形态）的结构变化；（3）采用象CFP-YFP Cameleon这样特别的FRET-工具的离子浓度。 2. FRET原理： 受激励后的荧光团（供体）将受激励的静能转移到一个光吸收分子（受体）。这种能的转移是非放射性的，其主要原因是供体和受体之间的偶极-偶极间的相互作用。 这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者