蛋白质与酶工程蛋白质双向电泳原理及实验步骤汇总.ppt

Bio-Safe 染色法 水洗3次，5min/次。 Bio-Safe染色1小时。 水洗30min. 图像扫描及软件分析 Molecular mass (kD) Isoelectric point 1 1 0 0 201 120 100 56 38 30 20 7 Fig1 上下图分别为正常大鼠和失神经大鼠腓肠肌蛋白双向电泳 图谱，右图为左图方框内的局部放大图。 谢 谢 ！ 两维间的平衡 等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于－80°保存数月。 但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS电泳能顺利进行。 建议方案：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。如果用TBP代替DTT则只需一步平衡。 二维SDS同普通SDS类似。 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。 Second Dimension SDSMultiple Gel Formats Mini Criterion PROTEAN 1°: 60 ?g sample, 20 kV-hr 2°: 8.6 x 6.8 cm, 40 min 944 spots 1°: 100 ?g sample, 50 kV-hr 2°: 13.3 x 8.7 cm, 1 hr 1,287 spots 1°: 150 ?g sample, 80 kV-hr 2°: 18.3 x 19.3 cm, 5.5 hr 1,724 spots 聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测 理想显色剂的7S 安全（safety）： 灵敏（sensitivity）： 简单（simplicity）： 特异性（specificity）： 快速（speed）： 稳定（stability）： 兼容性（synergy）： 适用于质谱的染色方法 考马斯亮兰（Bio-Safe? Coomassie? colloidal 250 stain） 银染（Silver Stain Plus? stain） 荧光染色（SYPRO? Ruby protein gel stain） 考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝检测范围30-100ng，灵敏度较低，但染色过程简单，所需试剂少，操作简便，无毒性，染色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度好。 胶体考马斯亮蓝染色的检测灵敏度为8-10ng，但染色时间较长（24-48小时），染色过程给下游质谱检测带来较多不便。 Bio-Safe染料是一种改良的胶体金染色方法。安全无污染，染色非常快（2小时），完全与下游质谱兼容。 银染 银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。 快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。 Bio-Rad有两种银染试剂盒： 普通银染试剂盒——质谱不兼容 增强型银染试剂盒——质谱兼容 荧光染料 SYPRO Ruby染料 灵敏度2-10ng，灵敏度与银染相仿，不对核酸染色 染色所需时间较短 染色的动态线性范围大大优于胶体金染色，扩展了约1000倍。 荧光试剂显色对蛋白质无固定作用，不干扰质谱或免疫检测过程 Cy3和Cy5 两种染料可分别对两种蛋白质样品进行荧光标记，在一块2-D胶上同步运行，可以很方便的找出差异 但因其需要对蛋白质进行共价修饰、改变了标记蛋白质的移动性能 由于荧光探针猝灭作用会引起快速衰减。蛋白与蛋白之间由于可被荧光团修饰的功能基团数目不同而使得灵敏度变化很大 荧光团的加入会降低蛋白质溶解性能。 凝胶的图像处理分析 典型流程 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递和解释： 2-DE数据库的建立： 综合的数据管理 PDQuest Image Differential Analysis Spot Cutting Protein Digestion Mass Spec PMF / MS-MS Global Database Search / Protein ID PDQuest Image Auto-annotation PDQuest Work Flow Acquire the Image Transform the Image Identify the Spots Compare Images Analyze the Data Excise Spot