070302生物化学实验技术全解.ppt

5. 核酸的沉淀分离 核酸分离纯化应维持在0-4℃的低温度条件下，以防止核酸的变性和降解。为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。 常用的沉淀分离法有： (1)有机溶剂沉淀法 (2)等电点沉淀法 (3)钙盐沉淀法 (4)选择性溶剂沉淀法 （1）有机溶剂沉淀法 由于核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下来。 核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关，相对分子质量106Da的双链DNA可以丝状纤维缠绕在玻棒上；相对分子质量稍小的双链DNA或单链DNA、RNA则以凝胶形式存在，这些核酸经离心后存在于沉淀中，用70%乙醇洗涤，除去其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。 (2) 等电点沉淀法 脱氧核糖核蛋白的等电点为pH4.2；核糖核蛋白的等电点力pH2.0-2.5；tRNA的等电点为pH5。所以将核酸提取液调节到一定的pH，就可使不同的核酸或核蛋白分别沉淀而分离。 (3) 钙盐沉淀法 在核酸提取液中加入一定体积比(一般为1/10)的10%氯化钙溶液，使DNA和 RNA均成为钙盐形式，再加进1/5体积的乙醇，DNA钙盐即形成沉淀析出。 (4) 选择性溶剂沉淀法 选择适宜的溶剂，使蛋白质等杂质形成沉淀而与核酸分离，这种方法称为选择性溶剂沉淀法 。 ①在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿/辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。 ②在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都进入水层，而蛋白质沉淀于苯酚层中被分离除去。 ③在DNA与RNA的混合液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA而与留在溶液中的RNA分离。 Copyright ? 2010 by Ouyang Hongsheng. All rights reserved. 第三章 膜分离技术 欧阳红生 动物生物技术系 吉林大学畜牧兽医学院 Email:biotechs@ Tel:0431概念 用人工合成的某种材料作为两相之间的不连续区间实现不同物质分离的技术叫膜分离。 基本原理 膜的作用是分隔两相界面，并以特定的形式限制和传递各种化学物质。它可以是均相的或非均相的，对称型的或非对称型的。中性的或荷电性的，固体的或液体的，其厚度可以从几微米到几毫米。 特点 膜分离操作简单、效率较高，没有相变，节省能耗，特别适合处理热敏性物质。 第三章 膜分离技术 第一节 透析 透析(dialysis)借助半透膜相隔的两相液体,利用具有不同截留相对分子质量的半透膜,使高渗溶液中的小分子穿过半透膜进入低渗溶液一侧,生物大分子被载留在膜的高渗溶液一侧,从而将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术.如把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行透析，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。 第一节 透析 透析(dialysis) 原理 透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。 透析的应用 利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。 影响透析速度的因素： （1）半透膜的通透性：市面上有商品化的不同型号的透析膜，透析管；常用的半透膜是玻璃纸或赛璐玢纸、火绵纸或称赛璐琔纸和其他改型的纤维素材料。但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。 影响透析速度的因素： （1）半透膜的通透性： （2）透析外液的更换：反复更换透析外液，增加透析速度；对流水透析，可进行初期透析；搅拌，使梯度差变得均匀，可增加透析速度。 （3）温度：温度增加，则透析速度增加，但要注意生物活性。 （4）压力：增加压力可加快透析速度，如真空透析。 透析袋的使用： 商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％