南农生物分离工程生物分离1细胞破碎.pptVIP

概述 有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积，使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁 。 分 类 革兰氏阴性细胞结构有三层：最外层约8mm厚，酶大多数镶嵌在这层膜上。革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构， 但有第二层肽聚糖层和胞浆空间。 第三层为浆膜层或内膜层，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性都有这一结构，该层主要由磷脂组成，还有分散的蛋白质分子和金属离子。 这三层有不同功能。外层及肽聚糖层使细胞有一定的机械强度；破坏该层是本章讨论的重点。浆膜层和细胞内膜控制细胞的渗透压，即将营养物质运送到细胞内，将代谢物排出胞外。 真核细胞，具有真正的细胞核，其结构要比原核生物复杂的多，以图所示的酵母菌为例，和原核细胞一样，真核细胞也具有一层细胞膜。 细胞破碎理论 1)、细胞破碎 A 压撞 B 剪切 C渗透 冻胀 D 破壁破膜 2)、产物释放  高压匀浆器 影响因素 操作压力p：p?, R? 。温度? 2?C /10MPa 。 破碎次数N：N?，R ?。 温度：比速度k与温度有关，温度?25?C，k?1.5倍。 细胞种类：如大肠杆菌比酵母易破碎 超声破碎法 超声破碎法 优点：适合于多种细胞的破碎 缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状；B、有效能量的利用率低；C、产热大，需控温； D、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。 机械法 优点 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适. 二、非机械法 Osmotic Shock(渗透冲击法) 最简单的是渗透冲击法。 此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂，释放胞内物。 细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容易溶破，动物细胞只有当其组织被机械切碎或匀浆后才易溶破。植物细胞很难溶破，因为植物细胞中含有大量的木质成分，通过渗透流很难渗透。 渗透流的动力来自渗透压，渗透压可以通过化学平衡来估算： P=RTC 该式称为范特苛夫定律。 许多细胞内溶质浓度大约为0.1M NaCl 或0.2M溶质 。 例：一种耐盐细胞其能积累细胞内低分子量卤化物，适应高渗透压，能在含有0.32mol/LNaCl, 0.02mol/LMgCl2 , 0.015mol/LCaCl2, 0.01mol/LFeCl3 的培养基中培养，当其从含盐量高的培养基中转移至清水中，在数分钟内能将胞内产物释放出来，试估计细胞膜所受渗透压的大小。（设操作温度为25℃） 解：细胞所受渗透压按照下式计算： P＝ RTC ＝ 8.314×298×(0.32×2＋0.02×3＋0.015×3＋0.01×4)×103 ＝1.94×106 Pa 冻-融法 细胞 -15℃冷冻、室温融化 细胞膜疏水键破裂，胞内水结晶膨胀破裂 温和、破碎率低 非机械法 优点： A、产品释放的选择性； B、提取速度和收效高； C、产品的破坏小； D、对外界环境，如pH和温度等要求低。 机械法和非机械法的比较 机械破碎法缺点： A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活； B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。 非机械破碎法缺点： A、引起新的污染，尤其是其他化学方法； B、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。 细胞破碎的评价 破碎率定义 N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。 直接计数法 方法：样本稀释 --- 染色 --- 上样 计数。 计算：同上。 优点：方法简单。 缺点： A、计数时间长 B、细胞聚集时，不利计数 C、染色误差。 细胞破碎的评价 间接计数法 方法：样本离心 --- 取上清液 --- 测特定蛋白质或酶 --- 与理论的最大值比较。(紫球藻细胞 藻红蛋白) 计算：Y(%)=100×(R/ Rm) Rm：理论最大值，R：实验测得值。 优点：A、方法客观可靠，尤其对蛋白质和酶，B、有多种选择的指标，胞内位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，灵活性大。 缺点：影响因素多，如温度、pH值、剪切力、溶液的稀释等。 解决办法：筛选相对稳定和恒定的指标。 基因工程表达产物 存在的问题 A、包含体 B、N-端多一