精选课件动物细胞与组织培养技术.ppt

第一节 概述 一、基本概念 1．动物细胞与组织培养(Cell and Tissue Culture) ：指从用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 是动物细胞工程的基础。 2、原代培养(Primary Culture)：亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进行培养的过程。 3．继代培养（ Secondary Culture ）：亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养. 4、细胞系(cell line)：由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。 5、细胞株(cell strain)：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。 二、动物细胞体外培养特点 动物细胞生长缓慢，培养时间长。 更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支原体）， 需要防治污染问题。 对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括PH值、温度、剪切力 对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。 原代细胞一般繁殖50代左右退化死亡。 总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。 三、动物细胞培养的发展历史 1885年，Wilhelm Roux （劳斯，德国）最先尝试离体培养鸡胚神经存活了一段时间。并且，他首次采用了“组织培养”一词。 1907年，美国胚胎学家Ross Harrison （哈里森）培养蛙胚神经细胞长出了轴突（盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）。他被公认为动物组织培养的开山鼻祖。 1912年,法国学者Alexis Carrel（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。在技术方面，卡雷尔把无菌操作技术引入组织培养中。1923年，他设计了卡氏培养瓶。 1913年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法。 1925年，Maximow采用双盖片法。 1934年，Gey和Lewis 用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计了多种类型的培养瓶。 1948年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还创建了单个细胞培养方法。 1951年，Pomerat设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究 1951年， 厄尔 （Earle） 发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。 1952年．Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌Hela细胞系。 1960年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的融合细胞。 1962年，冈田善雄又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。 四、动物细胞的体外培养一般条件 1、恒定的温度:37 ℃ 2、pH：最适为7.2～7.4  大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6，每种细胞都有其最适pH值. 当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。 3、 气体 气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2） 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中. 二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值. 　 4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、激素、生长因子等。 5、无菌 培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。 五、 动物细胞的体外培养生物学特性 贴壁依赖型细胞 1、贴壁依赖型细胞 含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外基质结合。 单层附壁培养：指动物细胞培养中，大多细胞必须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长。 在体外按照培养细胞的形态不同，主要可分为以下几类：成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞 （1）成纤维细胞型： 本型细胞的形态似在体内生长的成纤维细胞； 长梭形，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞核位于中央，胞质向外伸出