精选课件多糖分离纯化及含量测定1.ppt

多糖的分离纯化与含量测定 张黎明 天津科技大学生物工程学院 2013年4月29日 主要讲授内容 一、多糖的提取方法 二、多糖的纯化方法 三、多糖含量的测定方法 四、纯度与相对分子质量的检测 polysaccharide; separation；extraction; isolation purification; content determination; 前言 多糖在早期的天然产物化学研究中, 因活性不明显, 常作为无效成分弃去。 由于化学、生物学、药理学等学科的飞速发展, 自20世纪80年代来, 人们对多糖的生物活性有了新的认识。 药理实验研究显示, 多糖具有许多生物活性功能, 包括免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌、抗病毒、保护肝脏等, 且对机体毒副作用小。因此, 对多糖的研究开发已成为医药保健品行业热门领域。 如香菇多糖 、灵芝多糖 、云芝多糖 已在国内外临床上广泛应用。而其他一些多糖正在深入研究, 如桑黄多糖 、猪苓多糖 、人参多糖 、枸杞多糖 等。 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。 多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。 动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖； 植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理。 一、多糖的提取方法 1. 溶剂提取法 水提醇沉法、酸提法、碱提法、超临界流体萃取法 2. 酶解提取法 单一酶解法、复合酶解法 3. 强化提取法 超声波辅助提取法、微波辅助提取法、高压脉冲法 1. 溶剂法：水提醇沉法 多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。 用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗漉，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置一定的时间，多糖的质量分数和得率均较高。 影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 该种方法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。 但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。 溶剂法：酸提法 为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。 如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解； 含有胺基的多糖可使用乙酸或盐酸调节提取液成酸性进行提取，然后再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。 影响多糖提取率的因素有：水的用量、pH值、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高； 但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。 因此酸提法也存在一定的不足之处。 溶剂法：碱提法 有的酸性多糖, 或分子量较大的多糖, 在热水中溶解度不大, 一般在稀碱溶液中溶解度较大, 所以常用稀的NaOH 溶液或Na2CO3 溶液提取。不过用稀碱溶液提取时, 提取温度必须保持在10 ℃以下, 否则多糖容易发生降解反应。 多糖在碱性溶液中稳定，例如粘多糖的提取多采用碱提取法。 多糖碱法提取虽然可提高多糖的收率, 且可缩短提取时间, 但提取液中含有其它杂质如蛋白质, 粘度过大, 过滤困难, 且有些多糖在碱性较强时会水解。 通常先用热水法提取, 然后残渣再用稀碱溶液提取, 这样可将大部分多种类型的多糖提取出来。 溶剂法：超临界流体萃取法 超临界流体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，即密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。 超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。由于CO2 的超临界条件（TC＝31.26 ℃，Tp＝7.38 MPa）容易达到，常作为超临界萃取的溶剂，在压力为8～40 MPa 时的超临界CO2 足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入夹带剂后则可溶解极性化物。 由于糖类的化合物分子量较大、羟基多、极性大，用纯二氧化碳提取产率较低，加入夹带剂或加大压力则可提高提取率。该法的缺点是设备复杂，运行成本高，提