细胞融合操作规程1[精选].doc

细胞融合 实验材料 手术剪，镊子，离心机，蜡盘等。 实验所配试剂 1640基础培养液：取一包1640干粉，溶于1000 mL双蒸水中，慢慢加入2.5 g NaHCO3，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用。 青链霉素溶液（100×）：取青霉素100万单位和链霉素1 g，无菌溶于100mL已灭菌的三蒸水中，0.22 μm滤膜过滤除菌，1 mL/管分装，-20℃冻存备用。 1640完全培养液：向1640基础培养液中加入10％的小牛血清和1%青链霉素溶液（100×）（为养成良好的操作习惯，建议不加最好），摇匀，4℃冰箱保存备用。 HT培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入1 mL 100×的HT溶液，摇匀，4℃冰箱保存备用。 HAT培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入2 mL 50×的HAT溶液（使用前HAT有部分白色沉淀应充分混匀），摇匀，4℃冰箱保存备用。 GNK溶液： 准确称取KCL 0.4g ，NaCL 8g ，Na2HPO4·2H2O 1.77g(Na2HPO4·12H2O 3.56g)，NaH2PO4·H2O 0.69g(NaH2PO4·2H2O 0.78g)，酚红0.01g，葡萄糖2g，加DDW 定容至1000mL，调节pH 值至 7.2，高压灭菌，4保存备用。μg/只，皮下注射。免疫程序如下： 首次免疫：100μL抗原+100μL弗氏完全佐剂/只 加强免疫：100μL抗原+100μL弗氏不完全佐剂/只，于首免后2周后进行。共免疫3次，每次间隔2周。第二次免疫后的第十天断尾采血（一般尾部采血4μL，溶于200μL PBS混匀备用）检测效价，如果效价很低或没有效价，建议直接放弃，不用继续再免疫。如果效价可以，在二免后的2周进行三免，最后一次免疫10天后，断尾采血，用适当的抗原进行包被，用间接ELISA检测抗体效价，效价达到1:1600以上即可进行细胞融合。 超强免疫：最后一次加强免疫后2周，细胞融合前3~5天，尾静脉或腹腔注射50μg纯抗原。 2. 饲养细胞的制备 融合前1-2 d制备饲养细胞。取昆明鼠1只致死（收集小鼠血清，以供筛选时用该血清做阴性对照），75%酒精消毒体表，无菌手术剪刀轻轻剥去小鼠的腹部皮肤，以防止剪破腹膜，暴露腹膜。然后用5mL注射器和16号针头将5mL预冷的HAT打入小鼠腹腔，轻轻压挤腹部，重新吸出注入的液体（在吸取过程中为防止污染，避免针头刺破肠管），收取小鼠腹腔巨噬细胞。用HAT稀释至40ml，100uL/孔添加到4块96孔细胞培养板中，置37℃ 5% CO2培养箱中培养，第二天检查有无污染情况。 3. 细胞计数 为保证NS0细胞在融合时达到最佳状态和高活力，建议在融合时前一天给所需的每瓶NS0细胞换液，以备融合时使用。 80%左右NS0的细胞计数（三次平均数）：（11.6×105+9×105+3.7×105）/3=8.1×105/mL 脾细胞计数6.5×106/mL,大约是40mL有 2.6×108个细胞，两次计数相差不大，所以脾细胞数可固定为2.6×108个/40mL。 NS0细胞计数： 3.7×105个/mL（70%） 9×105个/mL（80%） 11.6×105个/mL（90%） 脾细胞计数： 4. 细胞融合 在40℃水浴中预热GNK溶液、PEG和HAT溶液； 免疫小鼠采血并分离血清，然后致死浸泡到酒精中； 收集NS0细胞于50 mL离心管中（为保证高融合率建议大于4瓶90%的NS0细胞），1000 r/min离心10 min，弃上清，用GNK洗一次； 5小鼠脾细胞的制备 依次剪开小鼠皮肤，腹膜暴露腹腔（建议为防止污染，建议至少用两套手术刀具，一套用于剥开小鼠外部皮肤和腹膜，另一套用于取出小鼠脾脏），取脾脏放置与尼龙纱布上充分研碎，并用GNK洗下去，收集脾细胞于50 mL离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清，打散细胞团； 将脾细胞与NS0骨髓瘤细胞混合于50 mL离心管中，加GNK溶液至40 mL，1000 r/min离心10 min，弃上清，打散细胞团（充分打散细胞团，以保证融合时的高融合率）； 为保证融合时的温度可以事先将混匀好的细胞在40℃水浴预热两分钟，然后在另一刚取出的40℃水浴烧杯中做融合，用1mL或大于1mL吸管将预热的50%PEG（pH8.0）滴加到融合管中，边加边轻轻摇动融合管，1min或80s内加完，并继续在水浴中缓缓摇动融合管1.5min。立即缓慢滴加37℃预热的GNK溶液15mL。加入步骤为：1 mL/30s，3 mL/30s，11 mL/30s。然后慢慢补加GNK溶液至40mL，37℃水浴静置5min，1000 r/min离心10 min，弃上清。 打散细胞团，