3_生物制品的制备2013分解.ppt

（二）分泌型的表达产物 分泌型的表达产物通常体积较大、浓度较低，必须在纯化以前进行浓缩 浓缩方法包括：沉淀、超滤 （三）细胞内可溶性表达产物 （四）细胞周质表达蛋白 周质表达的蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达之间的一种表达形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离纯化。 为了获取周质蛋白，大肠杆菌细胞经低浓度溶菌酶处理后，一般用渗透压裂解法获取。 由于周质中的蛋白仅有为数不多的几种分泌蛋白，同时又无蛋白水解酶的污染，因此通常能够回收到高质量的蛋白产物。 一、原材料的质量检测与控制 原材料的质量控制是要确保编码生物制品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。 第四节 生物制品的质量检测与控制 在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定； 在培养过程中，要求工程菌所含的重组质粒稳定，始终无突变； 在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。 二、培养过程的质量控制 产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。 原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热原质都控制在规定限度以下。 三、纯化工艺过程的质量控制 基因工程药物质量控制主要包括：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。 1、产品的鉴别 有许多方法可用于全面鉴定，如下表： 四、目标产品的质量控制 重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法 ①电泳方法：SDS，等电点聚焦，免疫电泳 ②免疫学分析方法：放免法，放射性免疫扩散法 酶联免疫吸附法，免疫印渍 ③受体结合试验 ④各种高效液相分析法 ⑤肽图分析法 ⑥Edman N末端序列分析法 ⑦圆二色谱 ⑧核磁共振 2、纯度分析 它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个方面的内容。 （1）目的蛋白质含量测定 通常采用的方法有还原性及非还原性SDS、等电点聚焦、各种HPLC、毛细管电泳（CE）等。 （2）杂质 ①蛋白类杂质 ②非蛋白类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、热原质、内毒素、致敏原及DNA。 3、生物活性测定 是保证基因工程药物产品有效性的重要手段，需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。 重组蛋白质是一种抗原，可用放射免疫分析法或酶标法测定其免疫学活性。 体内生物活性的测定要建立适合的生物学模型。体外生物活性测定的方法有细胞培养计数法、3H-TαR掺入法和酶法细胞计数等。 4、稳定性检测 稳定性检测是评价药品有效性和安全性的重要指标之一。 5、产品一致性的保证 1、液态保存 （1）低温保存：液态蛋白质样品在-10～-20℃以下冰冻保存比较理想。 （2）超低温保存：液氮超低温保藏 （3）在稳定pH条件下保存：蛋白质较稳定的pH一般在等电点，因而保存液态蛋白质样品时，调到其稳定的 pH范围内。 第五节 生物制品的保存与运输 （4）高浓度保存：一般蛋白质在高浓度溶液中比较稳定，这是因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，保存时浓度不能太低，否则可能引起亚基解离和表面变性。 （5）加保护剂保存：加入某些稳定剂可以降低蛋白质溶液的极性，以免变性失活。 一般蛋白质含水量超过10%时容易失活。含水量降到5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定，在干燥器中在4℃以下可保存相当长的时间。 2、固态保存 由于各种糖类制品的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。 三、糖类制品的分离纯化方法 非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。 降解法适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。如从软骨中分离提取硫酸软骨素，就是用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。 （1）提取方法 常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。 乙醇沉淀法：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离。4-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（CTA）等。 （2）分离方法 （1）提取方法（extraction ） 脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键